La métabolomique à base de RMN dans l'épilepsie pharmaco-résistante chez l'enfant – résultats préliminaires

La métabolomique à base de RMN dans l'épilepsie pharmaco-résistante chez l'enfant – résultats préliminaires

novembre 5, 2019 0 Par admin

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Abstract

Epilepsy in children is the most frequent, heterogeneous and difficult to classify chronic neurologic condition with the etiology found in 35–40% of patients. Our aim is to detect the metabolic differences between the epileptic children and the children with no neurological abnormalities in order to define the metabolic background for therapy monitoring. The studied group included 28 epilepsy patients (median age 12 months) examined with a diagnostic protocol including EEG, videoEEG, 24-hour-EEG, tests for inborn errors of metabolism, chromosomal analysis and molecular study. The reference group consisted of 20 patients (median age 20 months) with no neurological symptoms, no development delay nor chronic diseases. 1H-NMR serum spectra were acquired on 400 MHz spectrometer and analyzed using multivariate and univariate approach with the application of correction for age variation. The epilepsy group was characterized by increased levels of serum N-acetyl-glycoproteins, lactate, creatine, glycine and lipids, whereas the levels of citrate were decreased as compared to the reference group. Choline, lactate, formate and dimethylsulfone were significantly correlated with age. NMR-based metabolomics could provide information on the dynamic metabolic processes in drug-resistant epilepsy yielding not only disease-specific biomarkers but also profound insights into the disease course, treatment effects or drug toxicity.

Introduction

Based on the official International League against Epilepsy (ILAE) report, Fisher et al. proposed the following clinical definition of epilepsy embracing occurrence of any of the following conditions: – at least two unprovoked seizures which occurred >24 hours apart; – one unprovoked (or reflex) seizure together with a probability of further seizures similar to the general recurrence risk (at least 60%) after two unprovoked seizures, taking place over the next 10 years; – diagnosis of an epilepsy syndrome1

Being the most frequent chronic neurologic condition in childhood, epilepsy afflicts around 1% of children. During the first 10 years of life 1 out of 150 children is diagnosed with epilepsy, with the highest incidence rate observed during infancy2.

The etiology of epilepsy is found in 35–40% of patients. Large heterogeneity of epileptic syndromes and the pleiotropic effect of genes make classification of epilepsy difficult. Moreover, the research shows that between 6% and 41% patients, does not respond in an adequate manner to antiepileptic drugs (AEDs) and their disease evolve into refractory (intractable) epilepsy3,4.

In 2017, the ILAE released an update of classification of seizures and the epilepsies5,6,7,8. The diagnostic procedure involves the seizure-type diagnosis (focal, onset, generalized onset, unknown onset) the epilepsy-types diagnosis (focal epilepsy, generalized epilepsy, combined generalized and focal epilepsy, or unknown epilepsy types) and recognizing epilepsy syndromes1,5,6,7. Among the poor prognosis factors in epilepsy a younger onset and a longer epilepsy duration are being mentioned. As reveals from the Ramos-Lizana et al. study3 the worse prognosis is expected in children below 12 months old suffering from symptomatic epilepsy accompanied with pathological neuroimaging study, or with frequent seizures before diagnosis of drug-resistant epilepsy. Another strong factors indicating poor prognosis are reported by Sillanpaa & Schmidt9 and include seizures with weekly frequency during the first year of treatment or prior to treatment as well as diagnosis of remote symptomatic epilepsy.

Though magnetic resonance imaging (MRI) is an appropriate tool to be applied to identify an epilepsy cause (e.g., tumors, traumatic brain injury, vascular malformations, hippocampal sclerosis, cortical malformations), in nearly 30% of cases there are no clear epileptogenic lesions (non-lesional or MRI-negative)10. In vivo proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is helpful in localization or lateralization of the epileptogenic foci and in the patient monitoring during the antiepileptic therapy and/or after resection of the epileptogenic tissue. However, in case of the patients with non-lesional insular epilepsy the spectroscopic method is at least inadequate. Because there are only several lines present in the in vivo MR spectra – it is impossible to identify the molecular paths and find the real biomarkers from such spectra. The brain metabolites being disturbed are primarily N-acetyl aspartate (NAA), creatine (Cr) and phosphocreatine (PCr), cholines (Cho), glutamine (Gln) and glutamate (Glu)11,12,13,14. An additional difficulty is the fact that most of the works concern the epilepsy in adults, whereas, there is little data on the use of magnetic resonance spectroscopy in the studies of drug-resistant epilepsy in children. The latter, though valuable, comprise rather small and heterogeneous populations14,15.

High resolution in vitro NMR (HR NMR) spectroscopy of body fluids is more feasible for pediatric patients and gives insight into a significantly larger (about ten times) group of detectable metabolites. Application of multivariate projection methods to analyze the spectroscopic data allows for examination of the metabolome (i.e. detection of the low molecular weight metabolites present in a particular biological system: fluid, cells or tissue), to determine its changes and mutual correlations of the individual metabolites. Such approach to the studies of metabolism – called metabolomics16 – allows for better insight into the biological basis of drug resistance in epilepsy. Because metabolism is, an important regulator of neuronal excitability, thus its dysregulation after a seizure, may lead to many damaging consequences. The influence of the “disturbed metabolism” (which is, however, under control) is seen in the ketone diet – such diet is being applied to reduce or prevent seizures in children with drug-resistant epilepsy17.

Thus, serum 1H NMR based metabolomics approach seems to be more suitable to detect the metabolic signatures in epilepsy, to predict disease state and response to treatment. Serum as a systemic pool of metabolites, reflects all processes and their systematic disturbances, even those in the brain due to the bi-directional flow of endogenous metabolites between blood and brain compartments.

The central hypothesis of this work is that epilepsy has a unique chemical signature influencing the naturally occurring chemicals and metabolic pathways in the brain. Thus, our aim is to detect the metabolic differences between the epileptic children and the children with no neurological abnormalities in order to define the metabolic background for therapy monitoring.

Materials and Methods

Subjects selection

The study was approved by the ethical committee of the Silesian Medical University, and written informed consent was obtained from each child’s parent(s) or guardian to the participation of their child in the study. All methods were performed in accordance with the relevant guidelines and regulations.

48 patients were enrolled in the study. The patients were divided into two groups: the Epilepsy Group (EG) and the Reference Group (RG). EG included 28 individuals suffering from epilepsy (median age was 12 months, female to male ratio was 13:15). The seizure types, epilepsy types and epilepsy syndromes were defined according to the International League Against Epilepsy Classification and Terminology (ILAE 2017). All children with epilepsy (EG) underwent diagnostic protocol including EEG, videoEEG, 24-hour EEG (in selected sapienti), laboratory tests for inborn errors of metabolism, chromosomal analysis and molecular study. All patients with epilepsy were treated with 1 to 5 antiepileptic drugs (AEDs): VPA = 23 (47,9%), LVT = 11 (22,9%), VGB = 9 (18,8%), ACTH = 7 (14,6%), PB = 4(8,3%), CBL = 3 (6,3%), TPM = 2 (4,55%), LTG = 1 (2,1%), CLZ = 1(2,1%), OXC = 1 (2,1%). None of the patients was on the ketogenic diet (KD). As a result of treatment, 16 treated patients were seizures free.

EG was divided into 2 subgroups. The epilepsy group with seizures (EG1) included 12 patients with seizures in the course of study (median age was 10 months, female to male ratio was 4:8) [Table 1]. Age of epilepsy onset was 1–30 months. Focal onset seizures were classified in 2 patients, generalized onset seizures in 7 patients, focal and generalized onset seizures in 2 patients. Focal epilepsy type was classified in 2 patient, generalized type in 7 patients, combined focal and generalized type in 2 patients, epileptic spasm in 1 patient and epilepsy syndromes in 8 patients (West syndrome in 5, Lennox-Gastaut syndrome in 2, Dravet syndrome in 1). The etiology of epilepsy was established in 6 patients (structural etiology in 5 patients: hypoxic-ischemic encephalopathy in 4 and genetic etiology in 1 patient: Dravet syndrome) and remained unknown in 50% (n = 6). Development delay was identified in 10 patients.

Table 1 Clinical characteristics of epilepsy group (EG1) with seizures.

EG2 was the subgroup of the patients with no seizures during the study (median age was 13 months, female to male ratio was 9:7, n = 16) [Table 2]. Age of epilepsy onset was 1–36 month. Focal onset seizures were classified in 8 patients, generalized onset seizures in 5 patients, focal and generalized onset seizures in 2 patients. Epilepsy types were classified as: focal epilepsy in 8 patients, generalized epilepsy in 5 patients, combined focal and generalized epilepsy in 2 patients. Epilepsy syndromes was established in 6 patients (West syndrome in 4, Lennox-Gastaut syndrome in 1, Dravet syndrome in 1). The etiology of epilepsy was established in 12 (75%) patients (structural etiology in 10 patients: brain malformation in 6, hamartoma in 1, hypoxic-ischemic encephalopathy in 3, genetic etiology in 6 patient: Noonan syndrome, chromosomal aberration – trisomy 21, TSC, NF1, SCN1A mutation and metabolic etiology in 1 patient: methylomalonic aciduria) and remained unknown in 25% (n = 4). Development delay was identified in 13 patients, ASD in 1 patient.

Table 2 Clinical characteristics of epilepsy group (EG2) without seizures.

In all EG patients the concentrations of valproic acid in serum were in the therapeutic range, the patients had normal liver and renal functions and the serum transaminases levels were normal.

The RG group included 20 patients (median age was 20 months, female to male ratio was 7:13). All children revealed no neurological symptoms, no development delay nor chronic diseases. The family and gestation history were negative. No abnormalities were revealed in the routine laboratory tests, EEG and MRI of the brain. All children were drug free.

A relatively broad age span (from 3 to 48 months) of the EG group is caused by the differences in the age of epilepsy onset in the children and the resulting later diagnosis of the refractory epilepsy. However, in order not to reduce the already small group size, the youngest patients were not excluded from the study. On the other hand, since healthy children should not be subjected to research (due to ethical issues), the reference (RG) group was selected from the patients with minor health problems (according to the inclusion criteria described above) diagnosed in our Department. Such diagnostic procedures are particularly difficult under the age of 12 months. Thus, matching both groups on age was a challenge. To diminish the study limitation due to the age mismatch of the studied groups, the age correction was applied to the data, as described in detail in section 2.8.

Clinical presentations

The clinical characteristics of the EG patients are shown in Tables 1 and 2.

Serum samples preparation for NMR spectroscopy

Overnight peripheral blood samples were collected between 6 and 9 a.m. In 5 patients, the samples were collected twice: before and after AED modification. The total number of acquired serum samples was 53 (33 in the EG group and 20 in the RG group). The sera samples for the metabolomics experiment were prepared according to the modified Bruker protocol18 involving two-step thawing (in 4 °C and at room temperature) and using phosphate buffer (pH 7.4) with D2O and TSP. The aliquots of 600 µl of the solution were poured into 5 mm NMR tubes (Wilmad WG-1235-7) and stored at 4 °C until the spectroscopic analysis.

Measurement protocols

1H NMR spectra were acquired on a Bruker 400 MHz Avance III spectrometer (Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany) equipped with a 5 mm PABBI probe. The quality assurance, measurement and the post-processing procedures followed the protocol previously described by Boguszewicz et al. in the previous work18. Quality assurance tests were carried out in a daily manner prior to the start of the measurements, adjustment of acquisition parameters was always done for each measured sample. Spectra were acquired with constant receiver gain (90.5) and at temperature of 310 K. NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy), CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill), DIFF (diffusion edited) and two dimensional JRES (J-resolved) spectra were acquired for each blood serum sample.

The total number of acquired NMR spectra was 212 (4 spectra per each of 53 samples). Description and justification of the applied NMR acquisition sequences and parameters are available in Supplementary material.

Spectra post-processing

Exponential line broadening (0.3 Hz) and automatic phase correction were applied using Topspin (Bruker Biospin). The Amix software (Bruker Biospin) was used for alignment of NMR spectra to alanine signal at 1.5 ppm, followed by narrowing of the spectral region to the range between 9.0–0.5 ppm, removal of the residual water signal and spectral bucketing (with bucket size of 0.002 ppm). No normalization was applied. Our previous results show that strict adherence to the sample preparation protocol and the measurement protocol provides very stable and reproducible results allowing for biological interpretations18,19,20.

Metabolite quantification

1D positive projections of JRES spectra were used for quantification of low molecular weight metabolites, while the lipid signals were quantified based on the diffusion edited spectra. The peaks were integrated by area using AMIX (Bruker Biospin) and the integrals were measured in the spectral regions defined individually for each low molecular weight metabolite, whereas in case of the lipid signals 0.12 ppm range around a particular peak was applied.

Metabolite identification

Metabolites identification was done based on comparison with reference compounds library (in Chenomx NMR Suite Professional (Chenomx Inc., Edmonton, Canada)), multiplicity and scalar couplings information extracted from 2D JRES spectra as well as information from Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca/) and available literature21.

Age dependency

Because the concentration of many metabolites change during the development, especially in infancy and toddlerhood22,23,24, the integral intensities of the NMR signals were investigated upon their age dependency and corrected using the residual method 5e2328 « title = » O’Brien, L. M. et al. Ajustements statistiques pour la taille du cerveau dans les études de neuroimagerie volumétrique: quelques implications pratiques dans les méthodes. Psychiatry Res. 193 (2), 113-122 (2011). « > 25 , 26 sup>. La méthode des résidus consiste à déterminer le cours de la variation d’une caractéristique du groupe de contrôle et à calculer la valeur prédite de cette caractéristique. Les résidus sont acquis en soustrayant ce cours prédit des valeurs observées pour chaque sujet et représentent les déviations du cours prédit pour un groupe de contrôle (en utilisant les valeurs spécifiques du sujet pour chaque covariable) 25 , 26 sup>. La dépendance en fonction de l’âge a été déterminée à partir des profils métaboliques mesurés pour le groupe de référence – les patients ne révélant aucun trouble métabolique dû à l’épilepsie. 22 , 23 , 24 sup>. Dans ces travaux, différentes fonctions mathématiques sont utilisées pour décrire les modifications des concentrations métaboliques avec l’âge (fonctions monoexponentielles ou multiexponentielles, logarithme). et régression linéaire). p>

Dans notre approche, le pourcentage de la variance expliquée et la signification des paramètres de divers modèles dans la description de la relation entre les intégrales des métabolites et l’âge (fonction monoexponentielle, multiexponentielle, logarithmique et homographique La fonction homographique a été choisie car elle décrit le mieux la variabilité des données et les caractéristiques souhaitables de la monotonie. p>

Le coefficient de corrélation de rang de Spearman, avec un seuil de signification standard de p

Conformément à la méthode des résidus, les dépendances liées à l’âge des concentrations de métabolites ont été approximées par la fonction homographique C RG sup> (âge) définie par 27 sup>: p>

$$ {C} ^ {RG } (age) = {a} _ {1} frac {{a} _ {2}} {age} $$ span> p>

                    (1)                  p> div>

Il s’agit d’une fonction rationnelle avec une asymptote horizontale pour l’âge tendant à ∞ égal à un 1 sub>, alors que le paramètre a 2 sub> détermine la dynamique de développement observée dans le métabolome sérique. p>

Les paramètres a 1 sub> et a 2 sub>, décrivant les processus de maturation, ont été estimés à l’aide de l’algorithme de Gauss-Newton. et la méthode des moindres carrés non linéaires. p>

La validité statistique du modèle obtenu a été vérifiée avec le test de normalité des résidus et la signification statistique du paramètre estimé, la valeur R> 0,45. p>

On a supposé que les fonctions liées à l’âge reflétant les modifications métaboliques du RG étaient utilisées comme référence pour le calcul des valeurs résiduelles afin de rendre le niveau du marqueur métabolomique indépendant de l’âge pour le R (R RG sup>) et épilepsie (R EG sup>) groupes 25 , 26 sup>: p>

$$ {R} ^ {RG } = {C} _ {mesuré} ^ {RG} – {C} ^ {RG} (âge), , {R} ^ {EG} = {C} _ {mesuré} ^ {EG} – {C} ^ {RG} (age) $$ span> p>

                    (2)                  p> div>

({C} _ {mesuré} ^ {RG} ) span> et ({C} _ {mesuré} ^ {EG } ) span> sont les intégrales du métabolite quantifiées à partir des spectres RMN. p>

Analyse des données h3>

Des analyses multivariées des spectres RMN ont été effectuées à l’aide de SIMCA- Logiciels P (Umetrics, vs. 14) et Stata (StataCorp LP, vs. 13.1). Les variables de RMN ont été mises à l’échelle de Pareto. Les analyses initiales ont été effectuées à l’aide d’une analyse en composantes principales non supervisée. Ensuite, une analyse discriminante par les moindres carrés partiels orthogonaux (OPLS-DA) a été appliquée. Les résultats des techniques de projection multivariées (MPT) sont présentés graphiquement dans deux types de tracés, dont la description détaillée et l’interprétation sont disponibles sous la forme sup>. p>

En raison de la taille relativement petite du groupe étudié, la validation du modèle OPLS-DA supervisé a été effectuée à l’aide d’une validation croisée interne. La signification statistique du pouvoir prédictif estimé du modèle OPLS-DA a été testée à l’aide de l’ANOVA du test de validation croisée des résidus (cv-ANOVA). P>

Les intégrales des métabolites ont été évaluées quant à leur signification statistique avec t- test de Student et test de Mann-Whitney U (MWU) (pour les variables non distribuées normalement, Shapiro-Wilk). Les corrélations entre l’âge et les intégrales des métabolites ont été vérifiées à l’aide des coefficients de corrélation de rang de Spearman. Le logiciel Statistica (Statsoft, v. 12) a été appliqué aux statistiques univariées. P>

Le modèle de classification final basé sur les intégrales du métabolite et les intégrales du métabolite (R) corrigées en fonction de l’âge a été construit à l’aide de l’analyse discriminante linéaire (LDA) pour Z – données métabolites normalisées. La méthode LDA est axée sur la recherche de la combinaison linéaire des variables individuelles qui permettra la plus grande séparation entre les groupes. Le modèle LDA est basé sur l’hypothèse que les observations de chaque groupe (EG et RG) ont une distribution normale multivariée et que les matrices de covariance sont égales d’un groupe à l’autre, mais avec des moyennes différentes. Les hypothèses de normalité multivariée du vecteur d’observation et d’égalité de matrice de covariance ont été testées à l’aide des tests de Doornik-Hansen et de F (Box), respectivement. P>

Les résultats du LDA sont présentés sous forme graphique et présentés sous forme de tableau. L’évaluation de l’importance des métabolites pour la discrimination entre les groupes EG et RG est basée sur les coefficients de structure de la LDA mesurant la corrélation entre la fonction discriminante et chaque métabolite. L’évaluation de la performance de la classification LDA a été réalisée par étapes. Tout d’abord, le pouvoir prédictif du modèle LDA a été validé à l’aide de la validation non planée (LOO) en utilisant les probabilités antérieures de 0,53 et 0,47 pour les groupes EG et RG, respectivement. L’association entre les groupes étudiés est présentée dans un graphique des scores, où les scores discriminants LOO (échelle y) sont présentés graphiquement pour chaque patient en question (échelle x). P>

Ensuite, la courbe ROC était tracée comme une mesure pour évaluer la performance du classifieur LDA, qui correspond à la proportion totale des observations correctement classées et de l’aire sous courbe (AUC). p>

L’analyse de la voie métabolique a été réalisée à l’aide de MetaboAnalyst 4.0 (MetPA ) avec le test exact de Fisher choisi pour une analyse de surreprésentation et une centralité relative pour la topologie de la voie. p> div> div> section>

Résultats h2>

Figure 1 montre les spectres moyens 1H-CPMG de sérum sanguin provenant des groupes EG (noir) et RG (rouge) s – les principaux métabolites sont indiqués par des chiffres. p>

Figure 1 b> figcaption>

 figure1 div>

Spectres 1H-CPMG moyens des échantillons de sérum obtenus des groupes EG et RG. Les principaux métabolites détectés sont indiqués: 1, lipides; 2, BCAA (acides aminés à chaîne ramifiée: leucine, isoleucine et valine); 3, lactate; 4, alanine; 5, acétate; 6, N-acétyl-glycoprotéine (NAG); 7, la glutamine; 8, acétone; 9, pyruvate; 10, citrate; 11, créatinine; 12, choline; 13, méthanol; 14, glucose. P> div> figure> div>

Les directions de la plus grande variation parmi les quatre types de données de RMN acquises ont été visualisées à l’aide de la méthode PCA avec la meilleure séparation entre le EG et les groupes RG observés dans les spectres CPMG. Pour cette raison, seuls les spectres CPMG ont été soumis à des analyses OPLS-DA supervisées. Le graphique des scores PCA (figure 2a ) affiche le regroupement des enfants épileptiques (EG) et non épileptiques (RG) le long de la première composante principale (t [1]), expliquant 56,5% de la variation. dans les données. Les valeurs de qualité d’ajustement (R2) et de qualité de prédiction (Q2) du modèle PCA sont respectivement de 0,815 et 0,693. Afin d’identifier le phénotype moléculaire épileptique, une OPLS-DA à deux classes a été réalisée entre les groupes RG et EG. Le graphique des scores OPLS-DA (figure 2b ) affiche une séparation nette entre ces deux classes, le long de la composante prédictive (t [1]) représentant 15,1% (R2X = 0,151) de la variation prédictive – la quantité de variation dans les données qui est corrélée à la séparation de classe). Les paramètres du modèle pour la variation orthogonale (R2X (o) – variation des données non corrélées (orthogonal) avec séparation des classes, R2Y (cum) – somme totale de la variation liée à la séparation des classes expliquée par le modèle et Q2 – qualité de la prédiction) étaient les suivants: respectivement: R2X (o) = 0,423, R2Y (cum) = 0,648 et Q2 = 0,379. La variation totale expliquée par le modèle OPLS-DA est R2X (cum) = 0,662, la valeur p de cv-ANOVA

Figure 2 b> figcaption>

 figure2 img> source> picture> div>

( a b>) Analyse par spectrométrie de sérum de spectres de RMN 1M CPMG regroupement des enfants épileptiques (EG, Δ) et non épileptiques (RG, •). b b>) Le graphique de score R2X mis à l’échelle (les distances dans le tracé correspondent à la variation expliquée) obtenu à partir de l’analyse OPLS-DA du spectre RMN 1 H de CPMG d’échantillons de sérum de patients atteints d’épilepsie (EG 1 sub>, Δ, EG 2 sub>, ▼ span>) et les sujets de référence sans épilepsie (RG, •). Les informations sur les saisies chez les patients EG (EG 1 sub> et EG 2 sub>) n’ont pas été intégrées dans le modèle OPLS-DA et sont utilisées uniquement pour une évaluation visuelle de la classification des données. / p> div> figure> div>

Comme les profils métaboliques obtenus pour EG et RG diffèrent, il est possible que les crises d’épilepsie survenues avant la collecte de sang aient un impact sur le profil métabolique du sang. le sérum a également été examiné. Cependant, il n’existait aucune différence métabolique statistiquement significative (tests OPLS-DA et MWU) entre les groupes EG 1 sub> et EG 2 sub>. Les groupes EG 1 sub> et EG 2 sub> sont indiqués sur la figure. 2b avec divers marqueurs, mais au vu des résultats statistiques, les informations sur les saisies n’a pas été implémenté dans le modèle OPLS-DA et est uniquement utilisé pour l’évaluation visuelle du regroupement de données. p>

Les métabolites qui distinguent les classes sont identifiés sur la base du tracé de la ligne s de l’analyse OPLS-DA (Fig. . 3 ), où la couleur des points spectraux particuliers correspond à leur corrélation avec la ségrégation de classe (plus la couleur est rouge, plus la corrélation (p (corr)) est élevée): 18 sup>. L’analyse métabolomique OPLS-DA des spectres RMN sériques du sérum permet l’identification des métabolites discriminants (c’est-à-dire avec p (corr)> 0,3 28 sup>) pour les groupes étudiés. Les patients épileptiques se caractérisent par une augmentation des taux sériques de NAG, de lactate, de créatine, de glycine et de lipides (groupe méthylène à 1,3 ppm), alors que les taux sériques de L’acide citrique (à 2,55 et 2,7 ppm) et la choline sont diminués par rapport au RG. Les métabolites discriminants identifiés par OPLS-DA ont été quantifiés et évalués en termes de leur signification statistique avec les tests t-student et MWU. = « cliquez sur » data-track-action = « ancre de table ou « data-track-label = » link « href = » http://www.nature.com/articles/s41598-019-51337-z#Tab3 « > 3 répertorie les métabolites discriminants ainsi que les Les valeurs p des tests de signification statistique et les valeurs des coefficients p (corr) du modèle OPLS-DA. p>

Figure 3 b> figcaption>

 figure3 img> source> picture> div>

Le tracé de la lignée OPLS-DA indiquant les métabolites qui différencient te les groupes épileptique, EG, et non épileptique, RG. La corrélation de métabolites particuliers vers la ségrégation entre les groupes EG et RG (p (corr)) est évaluée en fonction de la barre de couleur associée. P> div> figure> div>

Tableau 3 Liste des métabolites avec des concentrations dépendantes de l’âge et des métabolites discriminants basés sur l’analyse OPLS-DA. b> figcaption> figure> div>

Identifier les différences potentielles entre les groupes EG et RG susceptibles d’être dépendants, les coefficients de corrélation de rang de Spearman ont été calculés entre l’âge et 27 intégrales de métabolites (14 métabolites énumérés à la Fig. 1 , ainsi que le formiate, la créatine, le glycérol, le méthanol, la phosphocholine, la diméthylsulfone, l’acétoacétate, 3- hydroxybutyrate, lysine, bétaïne, thréonine, glycine et pyruv ate) obtenu à partir du spectre moyen du sérum du groupe RG. Trois métabolites ont été significativement corrélés négativement (formiate, lactate et choline) et un métabolite était positivement corrélé (diméthylsulfone) avec l’âge (tableau 3 ). Les métabolites significativement liés à l’âge dans le groupe RG ont été approximés par la fonction homographique (Eq. 1 , tableau 3 ) pour obtenir le cours du métabolome de référence dans la maturation ( processus de développement). Pour supprimer la dépendance par rapport à l’âge de la concentration de métabolites, les valeurs résiduelles (Eq. 2 ) ont été calculés pour les données EG et RG. Ensuite, les données indépendantes de l’âge et corrigées (liées à l’âge) ont été soumises à une analyse statistique. Le formiate et la diméthylsulfone n’étaient pas importants pour la discrimination de classe avant et après correction de l’âge. La choline corrigée en fonction de l’âge n’a plus d’importance statistique, alors que le lactate corrigé en fonction de l’âge est devenu très proche de l’importance statistique avec la valeur p de 0,506 (Tableau 3 ). p>

La représentation en boîte à moustaches La figure 4 . p>

figure 4 b> figcaption>

 figure4 img> source> picture> div>

Représentation en boîte à moustaches des changements relatifs dans les métabolites significatifs identifiés par le modèle OPLS-DA comme étant importants pour faire la distinction entre les groupes EG et RG. Pour la choline et le lactate, seules les valeurs corrigées en fonction de l’âge sont présentées. P> div> figure> div>

Sur la base des résultats ci-dessus, le modèle de classification LDA a été créé à l’aide des métabolites significatifs (en tant que variables de classification ) listés dans les tableaux 3 et 4 . L’hypothèse modèle de normalité multivariée a été réalisée dans RG mais pas dans le groupe EG. Nous n’avons pas réussi à évaluer l’homogénéité de la matrice de covariance. Cependant, il convient de noter que les statistiques de test d’homogénéité de la matrice de covariance sont généralement sensibles à l’absence de normalité multivariée. Wahl et Kronmal suggèrent qu’une règle linéaire pour les petits échantillons (voire même les échantillons modérés) peut potentiellement conduire à une plus grande stabilité des résultats dans l’échantillon (avec ou sans normalité). 29 sup>. Si les rapports nj: p (où nj = nombre d’éléments du groupe j et p = nombre de variables de classification) sont faibles, l’utilisation d’une règle linéaire est privilégiée même avec une hétérogénéité de covariance 30 sup>. P>

Tableau 4 Résultats de l’analyse LDA. b> figcaption > figure> div>

La fonction discriminante linéaire a été calculée pour la séparation maximale des groupes. Table 4 montre les coefficients de structure. Tous les métabolites présentaient une corrélation positive, à l’exception du citrate (le coefficient de structure était de -0,56). Le résultat total de la classification LOO est indiqué dans le tableau 4 . Les probabilités antérieures dont dépendent en partie les résultats de la classification sont également reportées dans le tableau 4 . Les groupes connus sont répertoriés en lignes, tandis que les colonnes correspondent au groupe attribué par le modèle LDA. Sur la base de la classification LOO, True EG (28 observations) avait 75% des observations correctement classées et 25% des observations mal classées. Figure 5 visualise que le modèle LDA peut distinguer les groupes. p>

Figure 5 b> figcaption>

 figure5 / img> source> picture> div>

( a b>) nuage de points représentant les scores LOO appartenant aux groupes non épileptique (RG, •) et épileptique. (EG 1 sub >, Δ, EG 2 sub>, ▼ span>) enfants. b b>) graphique ROC pour le modèle de classification «laisser une sortie» (LOO); L’ASC est égale à 0,808 et l’IC à 95% est égal à (0,686, 0,931). Le seuil proposé était de 0,02 et l’indice de Youden de 0,61. P> div> figure> div>

La courbe des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) est utile pour évaluer la capacité d’un biomarqueur à classifier membres du groupe et quantifier la capacité de diagnostic du modèle LDA. L’efficacité potentielle maximale d’un biomarqueur exprimée dans l’indice de Youden ainsi que l’aire sous la courbe ROC (AUC) constituant un résumé numérique commun de la courbe ROC sont fournies à la figure 5b qui affiche le ROC courbe en tant que graphique de la sensibilité en fonction de la spécificité 1 des scores LOO de la figure 5a . La sensibilité est la fraction des cas d’épilepsie correctement classés par le modèle LDA, alors que la spécificité est la fraction des cas non épileptiques correctement classés. La probabilité antérieure de survenue de cas d’épilepsie était de 0,53, comme l’indique le tableau 4 . La performance globale du modèle LDA dans le contexte de l’analyse ROC est résumée par la CUA. Les estimations de l’ASC (0,808) et de l’IC à 95% (0,686, 0,931) correspondent bien. Le seuil proposé était de 0,02. P>

L’analyse de la voie métabolique conjointe montrant la modification des voies métaboliques dans le groupe EG est présentée à la Fig. 6 . Les voies de pénétration ont été identifiées sur la base de métabolites significativement altérés, répertoriés dans le tableau 3 et 6 (à l’exception des métabolites lipidiques et des glycoprotéines (NAG)). NAG a été implémenté dans l’analyse en tant que gène 1401 correspondant à la protéine C-réactive (NAG est considéré comme un marqueur RMN de l’inflammation). Table 5 résume les 11 voies métaboliques identifiées, à partir desquelles t 5 se sont révélés être significativement modifiés en termes d’enrichissement de la voie (p 0,1): métabolisme du glyoxylate et du dicarboxylate, métabolisme de la glycine sérine et de la thréonine, métabolisme du cyanoaminoacide, cycle du citrate (cycle du TCA) ainsi que le métabolisme du glutathion. La numérotation dans la table 5 correspond aux nombres de la figure 6 . p>

Figure 6 b> figcaption>

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L’analyse des voies articulaires révélant les voies métaboliques modifiées dans le groupe EG. 1 – métabolisme de la sérine glycine et de la thréonine; Cycle 2 – citrate (cycle TCA); Métabolisme du 3 – glutathion; Le métabolisme du 4 – glyoxylate et du dicarboxylate; 5 – Métabolisme des acides cyanoaminés. P> div> figure> div>

Tableau 5 Résultats de l’analyse de la voie conjointe à partir de métabolites discriminants entre les groupes EG et RG. b> figcaption> div> div> div> section>

Discussion h2>

L’étude présentée rapporte des différences métabolomiques sériques significatives entre les jeunes enfants atteints d’épilepsie pharmacorésistante diagnostiqués cliniquement et les individus de référence non épileptiques âgés de 2 à 48 mois. Plusieurs méthodes statistiques et de classification (supervisées et non supervisées) ont été appliquées afin de modéliser et d’expliquer ces changements métaboliques. Sur cette base, nous avons tenté de créer un modèle prédictif pour la détection de l’épilepsie pharmaco-résistante chez les patients pédiatriques. Les facteurs susceptibles d’affecter les résultats ont été supprimés (par exemple, les différences liées à l’âge) ou examinés de manière approfondie (par exemple, l’influence des AED) dans la section ci-dessous. Bien que la taille du groupe étudié soit relativement petite, il a toutefois été difficile de rassembler un groupe représentatif plus important en raison de l’âge très jeune des patients pour une étude prospective. Pour cette raison, la validation externe des modèles multidimensionnels obtenus n’a pas été possible et la méthode LOO a été utilisée. Le modèle d’analyse discriminante linéaire prédictif a correctement classé les cas dans 80% (n = 16/20) et 75% (n = 21/28) des groupes RG et EG, respectivement. Compte tenu de la nature extrêmement complexe des données et de l’énorme poids du problème, ces résultats semblent être importants pour ce qui est de la capacité des modèles basés sur les données spectroscopiques de sérum RMN à classifier les jeunes enfants épileptiques et non épileptiques. p>

Les crises épileptiques sont activées par les hormones sécrétant le système neuroendocrinien. Les hormones induisent des contractions des muscles du corps entier et augmentent les demandes en oxygène cardiaque, musculaire et cérébral, non satisfaites par les difficultés respiratoires. Du lactate, de l’urée et de l’ammoniac sont libérés par les tissus en tension et, simultanément, de la créatine kinase et de la myoglobine s’échappent dans le sang des muscles squelettiques exaspérés. Cela déclenche une réaction inflammatoire accompagnée de libération de cytokines et de leucocytose. 31 sup>. Le système nerveux central est probablement à l’origine de ces processus inflammatoires. Cependant, ils peuvent pénétrer dans le système circulatoire en raison de la rupture de la barrière hémato-encéphalique. 32 sup>. Les événements inflammatoires critiques, contribuant vraisemblablement à l’épilepsie, peuvent être considérés comme une source potentielle de biomarqueurs moléculaires et devenir des cibles pour les approches thérapeutiques de l’épilepsie. 33 , 34 , 35 , 36 sup>. P>

Les changements métaboliques dus aux crises tonico-cloniques généralisées, au statut épileptique, mais même aux crises partielles, sont si profonds qu’on peut les analyser analyses de sang sur le sang 36 , 37 sup>. La réponse d’un organisme à une maladie ainsi que les facteurs environnementaux et liés au traitement sont reflétés dans la composition métabolique du sérum sanguin, les biomarqueurs systémiques, spécifiques à un état pathologique donné de l’épilepsie, peuvent également être déterminés par métabolomique 38 sup>. Bien que l’identification de biomarqueurs de l’épilepsie ait été au centre des préoccupations de la dernière décennie, la nature complexe et multifactorielle de l’épilepsie et de son hétérogénéité rendent ce sujet encore ouvert à la recherche 35 sup>. En outre, le nombre de publications traitant de la recherche de biomarqueurs caractéristiques de l’épilepsie chez les enfants est rare. P>

Le présent L’étude montre que les concentrations sériques de NAG, de créatine, de lipides (à 1,3 et 0,9 ppm), de glycine et de lactate sont augmentées chez les enfants atteints d’épilepsie résistante aux médicaments, de sorte que ces métabolites pourraient être considérés comme les biomarqueurs systémiques d’une utilité diagnostique. des signaux lipidiques, la signification statistique n’est atteinte que pour les protons de méthylène – ce signal appelé «lipides mobiles» (ML) à 1,3 ppm est dû aux chaînes acyle grasses -CH 2 sub> – dans les triacylglycérides Considérant que l’augmentation du lactate devient significative (p = 0,0506) après correction pour tenir compte de la dépendance à l’âge, le niveau d’acide citrique (les signaux à 2,55 et 2,7 ppm) est significativement diminué dans EG par rapport au groupe de référence non épileptique, les changements de choline ne sont pas importants après la correction liée à l’âge. Dans la présente étude, aucune différence significative n’a été observée entre les groupes EG et RG en ce qui concerne les taux de glucose totaux et il n’y avait aucun biomarqueur significatif pour la discrimination des EG 1 sub> et EG 2 sub> groupes. L’analyse de la voie articulaire a révélé 5 voies métaboliques sensiblement modifiées, mais avec seulement deux métabolites impliqués, la glycine (4 voies) et le citrate (2 voies). P>

Ces résultats doivent être analysés en tenant compte des processus qui accompagnent la crises d’épilepsie – aux niveaux mitochondrial, cellulaire et systémique, ainsi que le processus thérapeutique. Dysfonctionnement mitochondrial, hypoxie d’origine convulsive, formation de ROS résultant de la réoxygénation du tissu aria-label = « Référence 39 » data-test = « citation-ref » data-track = « click » -action = « ancre de référence » data-track-label = « lien » href = « http://www.nature.com/articles/s41598-019-51337-z#ref-CR39 » id = « ref-link- section-d61055e4565 « title = » Chang, S.-J. & Yu, B.-C. Questions mitochondriales cérébrales: dysfonctionnement mitochondrial et statut oxydatif dans l’épilepsie. J Bioenerg Biomembr. 42, 457–459 (2010).  » > 39 sup>, dérégulation et inflammation GABAergic 40 sup> sont parmi les processus principaux caractéristiques du cours sur l’épilepsie 41 sup>. P>

Le rôle du stress oxydatif dans les épilepsies est déjà bien reconnu 42 sup>. La formation de ROS commence par des électrons non appariés s’échappant de la chaîne de transport d’électrons et se combinant à l’oxygène moléculaire, produisant ainsi la formation de superoxyde. Les superoxydes réagissent facilement avec les composants membranaires (c.-à-d. lipides et protéines) et ADN, d’où l’augmentation plus longue des ROS, le risque plus élevé de neurodégénérescence, comme dans l’épilepsie 38 , 43 sup>. Cet effet dépend de l’âge et, vraisemblablement, l’épileptogenèse est strictement associée à un dysfonctionnement mitochondrial dû à un stress oxydatif chronique 44 sup>. Liang et Patel 45 sup> ont démontré que les crises épileptiques persistantes (status epilepticus) causent des dommages oxydatifs à l’ADN et aux composants de la membrane cellulaire entraînant la carbonylation des protéines, la formation d’oxyde nitrique et la peroxydation des lipides. Bien que les taux de marqueurs oxydatifs aient été significativement augmentés chez les patients épileptiques, il n’a pas été confirmé que les antiépileptiques aient une incidence sur les niveaux des marqueurs, ce qui suggère que ce sont principalement les convulsions et le stress oxydatif induit qui sont responsables des biomarqueurs 46 sup>. P>

Dans notre étude, l’évolution de la concentration de lactate, de créatine, de citrate et de lipides peut être dans une hypoxie tissulaire, altération de l’oxydation mitochondriale (principale cause de l’augmentation des taux de BCAAs) 47 sup>) résulte en un lactate global et localisé sur-produit et sous-utilisé. Bien que nous observions une augmentation du lactate, il n’y a pas d’augmentation évidente des BCAAs, seule une glycine plasmatique élevée est observée dans les sérums des patients atteints de EG. La glycine, l’acide aminé le plus simple et non essentiel, est impliquée dans De nombreux processus biologiques, tels que la production d’ADN, de phospholipides et de collagène par le corps, sont également nécessaires à la synthèse du glutathion (piégeur de radicaux libres dans le système nerveux) et participent à la libération d’énergie. Il fonctionne à la fois comme neurotransmetteur inhibiteur et excitateur et, à des concentrations élevées, peut entraîner une excitoneurotoxicité, des convulsions et des lésions cérébrales. 48 a > sup>. L’homéostasie de la glycine est donc importante pour le maintien de l’équilibre entre l’excitabilité neuronale renforcée et diminuée. Des concentrations plus élevées de glycine et de lactate dans le plasma et dans le LCR ont été rapportées dans un sous-groupe de mitochondriopathies lié à des anomalies liées à des grappes fer-soufre. 49 sup>. En outre, le métabolisme de la glycine sérine et de la thréonine ainsi que les métabolismes des glyoxylates et des dicarboxylates, des acides cyanoaminés et du glutathion, où la glycine est également impliquée, ont été répertoriés par l’analyse de la voie commune comme significativement modifiés dans le groupe EG. Cependant, une raison plus prosaïque des taux de glycine plus élevés que pour le groupe de référence semble également être importante – cela peut être dû au fait que presque tous les patients reçoivent de l’acide valproïque, un antiépileptique. L’APV est l’un des médicaments de première intention pour le traitement de tous les types d’épilepsie et ses principaux facteurs de risque incluent le jeune âge et la polythérapie. 50 sup>. L’influence inhibitrice de l’acide valproïque et de la valproyle-CoA sur le complexe enzymatique de clivage de la glycine, entraînant des quantités élevées de glycine dans le sérum, est connue depuis 1980. 51 sup>. Des taux élevés de glycine dans le sérum ont été confirmés (avec l’alanine et la sérine, toutefois) chez des patients épileptiques traités uniquement avec l’AVP. 52 sup> et chez des patients recevant une VPA en association avec d’autres médicaments antiépileptiques 53 sup>. Modifications importantes des profils de laboratoire relatifs aux acides aminés sériques (augmentation de la glycine et de la glutamine et diminution des taux d’arginine, d’ABC, d’histidine, de méthionine, de phénylalanine et de taurine , thréonine et tryptophane) chez des patients épileptiques traités avec des DEA ont été découverts par Rao et coll. i>. aria-label = « Référence 54 » data-test = « citation-ref » = « cliquez sur » data-track-action = « ancre de référence » data-track-label = « link » href = « http://www.nature.com/articles/s41598-019-51337-z#ref-CR54 » id = « ref-link-section-d61055e4638 » title = « Rao, ML, H., H., Scheid, C., Kuttler, ADS et Froscher, W. Acides aminés sériques, statut hépatique et antiépileptique dans le traitement de l’épilepsie. L’épilepsie. 34, 347–354 (1993). « > 54 sup>. Cependant, ces changements n’étaient pas corrélés à l’âge, à la durée de la maladie ou à la fréquence des crises, ni au type de crise 54 sup>. Le groupe étudié était large (73 patients épileptiques), mais il était hétérogène en fonction de l’âge, ce qui peut avoir de l’importance, surtout dans le cas des comparaisons avec très jeunes enfants. et autres i>. 55 sup> affirment également que les taux plasmatiques d’acides aminés chez les patients épileptiques peuvent être liés à leurs médicaments et ont confirmé que l’APV augmentait les taux plasmatiques de glycine. Scholl-Bürgi et autres i>. 56 sup> l’utilisation de la chromatographie par échange d’ions n’a révélé aucune influence détectable de l’âge, du sexe et des DEA sur les ratios liquide céphalorachidien / plasma de la glycine (ainsi que de l’alanine, de l’arginine, de l’histidine, de la lysine , ornithine, proline et thréonine) mais lors d’études ultérieures sur le groupe homogène d’enfants atteints d’acidémie propionique ont montré que la glycine seule est élevée et que les médicaments (notamment l’acide valproïque) peuvent influer sur les concentrations plasmatiques d’acides aminés à un degré variable 57 sup>. Ainsi, nos observations par RMN 1H sont généralement conformes aux données mentionnées, malgré les diverses techniques d’analyse utilisées. Dans notre groupe EG, la glycine sérique est augmentée et la valeur p (p = 0,039) est significative dans le test U de Mann-Whitney. p>

Il est également affirmé que le traitement par l’APV altère le métabolisme des lipides 58 sup> et pourrait conduire à une élévation transitoire des tests de la fonction hépatique chez 15 à 30% des patients et à une hépatotoxicité rare et fatale 59 sup>. Ainsi, il existe des facteurs de risque clairs et confirmés pour l’hépatotoxicité associée à l’acide valproïque. L’un des marqueurs de l’atteinte hépatocellulaire est une augmentation des concentrations sanguines de triglycérides 60 sup>. Les triglycérides étaient en fait significativement plus élevés chez les patients traités avec des DEA en polythérapie qu’en monothérapie un 61 sup>. Dans notre étude, le signal lipidique du méthylène CH 2 sub> est nettement plus élevé (valeur p égale à 0,023) chez les patients traités. avec l’AVP et d’autres anticonvulsivants que dans le groupe de référence. p>

Nous n’avons observé aucune alternance statistiquement significative des autres taux sériques d’acides aminés (AA). Ces changements sont rapportés dans l’épilepsie humaine, bien que les résultats soient souvent contradictoires. Chez les adultes épileptiques, la diminution de l’AA est rapportée après des crises tonico-cloniques aiguës et est partiellement expliquée par une stimulation musculaire et métabolique accrue, similaire à celle observée lors d’un entraînement intense. 62 , 63 sup>. En outre, la libération d’hormones du stress au cours de la crise pourrait également réduire les niveaux d’acides aminés dans le plasma 55 sup>. P>

Le sérum des patients EG présentait des taux de créatine / phosphocréatine supérieurs à ceux des sujets de référence, mais les différences de Des taux de créatine accrus ont été rapportés dans la dystrophie myotonique 64 sup>. La créatine et le phosphate de créatinine sont présents dans le sang, les muscles et les organes, tandis que la phosphocréatine est un donneur de phosphate pour la génération d’ATP. La créatine est synthétisée dans le foie et Les reins et leur niveau perturbé peuvent refléter une altération du fonctionnement du foie. On peut donc supposer que la créatine élevée dans les échantillons de sang prélevés sur les patients atteints d’EG indique une augmentation de la demande en énergie sous forme d’ATP et d’acides gras, à la fois pendant la maladie et en raison d’une insuffisance hépatique. Cependant, cette augmentation du niveau peut également être associée – dans une certaine mesure – au stress oxydatif, car toutes les isoenzymes de la créatine kinase sont extrêmement susceptibles aux dommages oxydatifs. 65 sup>. P>

Un autre métabolite jouant un rôle métabolique multidimensionnel important est le citrat Les fluctuations des taux de citrate sont souvent considérées comme un outil de diagnostic ou un biomarqueur utile. 66 sup>. La majeure partie du citrate dans le sang circule librement et le quota restant est complexé au calcium, au potassium et au sodium. Les molécules de citrate sont des molécules de signalisation dans les processus d’inflammation et dans les débuts de la stéatose hépatique non alcoolique. Le cycle de l’acide citrique (cycle du TCA) ou cycle de Krebs est le processus métabolique central de la cellule. 67 sup>. Le citrate mitochondrial est transporté à l’extérieur de la mitochondrie par le transporteur de citrate (CIC). La disponibilité du citrate dépend donc de la quantité de citrate transporté à partir de la mitochondrie. Toutefois, pendant le stress oxydatif, la fonction mitochondriale est altérée. label = « Référence 68 » data-test = « citation-ref » data-track = « cliquer » data-track-action = « ancre de référence » data-track-label = « link » href = « http: // www. nature.com/articles/s41598-019-51337-z#ref-CR68 « id = » réf-link-section-d61055e4723 « title = » Tretter, L. & Adam-Vizi, V. Inhibition des enzymes du cycle de Krebs par l’hydrogène Peroxyde: un rôle clé de l’α-cétoglutarate déshydrogénase dans la limitation de la production de NADH sous un stress oxydatif, J. Neurosci, 20, 8972–8979 (2000). « > 68

, 69 sup>. Le citrate, ainsi que la glycine, est également impliqué dans le métabolisme du glyoxylate et du dicarboxylate, qui a été modifié de manière significative en termes d’enrichissement de la voie. P >

L’une des différences les plus marquées entre les groupes EG et RG concerne les groupes NAG, principalement la N-acétylglucosamine et l’acide N-acétylneuramique – ce sont des protéines de phase aiguë aux propriétés anti-inflammatoires et sont davantage exprimées lors des réactions inflammatoires et immunitaires 70 , 71 sup>. C’est pourquoi NAG est appelé marqueur d’inflammation par RMN. Bien que NAG soit plus élevé chez les enfants que chez les adultes, la N-acétyl-glycoprotéine ( Le signal NAG) à 2,07 ppm dans le groupe EG reflète vraisemblablement les processus inflammatoires, car il est comparé à celui du groupe RG du même spectre d’âge. Łukasiuk et al i>. 72 sup> justifient l’utilité des protéines reflétant l’inflammation ou la neurodégénérescence dans une lésion épileptique en tant que biomarqueurs moléculaires potentiels. Ces biomarqueurs sont incontestables. Cependant, à ce jour, les seules protéines inflammatoires proposées comme marqueurs de l’épileptogenèse sont la protéine C-réactive, l’interleukine 1-bêta et l’interleukine 6. 72 sup> – vraisemblablement, car leur présence ou leur excès dans le sang peut survenir à la fois en » débordement « de molécules neuro-inflammatoires et en raison d’une inflammation périphérique . p>

Une étude similaire a été réalisée par Murgia et autres i>. 73 sup> chez les sujets adultes atteints d’épilepsie, cependant, ils excluaient les patients recevant de l’acide valproïque et du lacosamide. Leurs principaux résultats dans le sérum de l’adulte épileptique résistant aux médicaments 73 sup> sont les concentrations diminuées de glucose, de citrate et de lactate et les concentrations accrues de corps cétoniques (butyrate 3-OH, acétate, acétoacétate et acétone) par rapport La seule caractéristique commune est la diminution du taux de citrate – elle reflète donc vraisemblablement le stress oxydatif. La divergence entre les profils métaboliques des adultes et des enfants atteints d’épilepsie semble toutefois prévisible, car les profils métaboliques dépendent de l’âge et reflètent différents processus de vieillissement. 74 sup>. En outre, la spécificité selon l’âge est également responsable d’un taux différent de métabolisme du valproate et donc, d’un degré d’hépatotoxicité différent – les personnes âgées peuvent être plus vulnérables aux effets indésirables des médicaments antiépileptiques que les jeunes enfants qui subissent des changements de maturation significatifs. p>

La principale limite de l’étude – la taille relativement réduite des groupes de patients dans les différentes catégories d’âge – a évidemment un effet préjudiciable sur différencier les effets liés à l’épilepsie de ceux dus à l’épilepsie et rend difficile la validation externe des modèles multivariés. Malgré ces menaces, nous avons décidé de procéder à la modélisation en utilisant les données corrigées en fonction de l’âge et de renforcer l’analyse en appliquant diverses méthodes de modélisation multivariée. Nous croyons que nos résultats des études sérologiques sur l’épilepsie par RMN 1H sont importants, car nous n’avons pas beaucoup d’articles sur ce sujet et encore moins d’exemples montrant l’utilité du diagnostic. s des techniques de spectroscopie RMN haute résolution chez de jeunes enfants épileptiques. Les études sur sérum de RMN et la métabolomique à base de RMN fournissent des informations importantes sur les processus épileptiques sous-jacents et peuvent être utiles pour comprendre l’épilepsie et les effets thérapeutiques chez les enfants. P>

Approbation éthique h3>

Toutes les procédures réalisées dans le cadre d’études impliquant des participants humains étaient conformes aux normes éthiques du comité de recherche institutionnel et / ou national et à la déclaration d’Helsinki de 1964 et ses modifications ultérieures ou à des normes éthiques comparables. p>

Consentement éclairé h3>

Le consentement éclairé a été obtenu des représentants légaux de tous les participants individuels inclus dans l’étude. P> div> div> section>

Conclusion h2>

À notre connaissance, il s’agit du premier essai de description métabolique de l’épilepsie pharmaco-résistante chez les jeunes chez les enfants et les nourrissons utilisant la métabolomique à base de RMN 1H. Nous avons identifié 6 métabolites sériques distinguant les patients épileptiques du groupe de référence. Ces métabolites sont impliqués dans 11 voies métaboliques, dont 5 ont été altérées de manière significative. Bien que l’interprétation des résultats nécessite une vérification sur un groupe plus large de patients, les premiers conjectures indiquent toutefois la coïncidence d’un stress oxydatif (diminution du citrate et d’une augmentation du lactate, de la créatine et des lipides), d’un état inflammatoire (augmentation du taux de N-acétyloglycoprotéine), ainsi que les perturbations métaboliques liées au traitement par l’acide valproïque (entraînant vraisemblablement une glycine élevée) en tant que schéma métabolique caractéristique de l’épilepsie pharmaco-résistante chez l’enfant. De plus, nous avons identifié 5 voies métaboliques altérées de manière significative (cycle du TCA, métabolisme du glutathion et métabolismes de plusieurs acides aminés, ainsi que métabolisme des glyoxylates et des dicarboxylates) dans le groupe épilepsie, dont quatre impliquant la glycine et deux impliquant le citrate. Le phénotypage métabolique de la thérapie chez les jeunes enfants épileptiques semble être utile pour mieux comprendre les mécanismes de résistance au traitement ou pour aider au diagnostic. P> div> section>                                                  

Disponibilité des données h2>

Les ensembles de données générés pendant et / ou analysées au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l’auteur correspondant sur demande raisonnable. p> div> section>

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