Contrôle spécifique au circuit des entrées entorhinales médiales du gyrus denté par des NMDRA présynaptiques atypiques activés par des astrocytes [Neuroscience]

Contrôle spécifique au circuit des entrées entorhinales médiales du gyrus denté par des NMDRA présynaptiques atypiques activés par des astrocytes [Neuroscience]

juillet 11, 2019 0 Par admin

Iaroslav Savtchouk , Amalia Di Castro , Rugina Ali , Hiltrud Stubbe , Rafael Luján et Andrea Volterra

  1. Edité par Per Jesper Sjöström, Université McGill, Montréal, Canada, et accepté par Gina G. Turrigiano, membre du comité de rédaction, le 5 mai 2019 (reçu pour examen le 18 septembre 2018).

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Importance

Nous avions précédemment identifié un mécanisme contrôlant la probabilité de libération de l’émetteur au niveau des synapses excitatrices des cellules granuleuses (PP) –granule, un circuit lié à la mémoire qui tourne mal dans la maladie d’Alzheimer et l’épilepsie du lobe temporal. Nous avons découvert que le mécanisme impliquait l’activation des récepteurs présynaptiques du N- méthyl- d- aspartate (pré-NMDAR) par les astrocytes, mais nous ne pouvions pas expliquer ses spécificités, notamment en expliquant pourquoi les pré-NMDAR étaient activés dans des conditions qui ne le sont pas. Nous montrons que les pré-NMDAR ( i ) contiennent une sous-unité atypique, GluN3a, responsable de leurs propriétés et ( ii ) sont localisés dans les terminaisons PP face à des astrocytes, restreints à un sous-ensemble d’afférents PP et ne contrôlant que les synapses réalisées par ces afférents. Ce mécanisme modulateur spécifique des circuits par les astrocytes peut être important pour le traitement de la mémoire et ses modifications dans les conditions pathologiques.

Abstrait

Ici, nous avons étudié les propriétés des récepteurs présynaptiques du N- méthyl- d- aspartate (pré-NMDAR) au niveau des connexions excitatrices corticohippocampiques entre les afférences du chemin perforant (PP) et les cellules granulaires dentées (GC), un circuit impliqué dans le codage de la mémoire et affecté centralement Maladie d’Alzheimer et épilepsie du lobe temporal. Il a déjà été rapporté que ces récepteurs augmentaient la probabilité de libération de PP en réponse aux gliotransmetteurs libérés par les astrocytes. Leur activation s’est produite même dans des conditions de Mg 2 élevées et d’absence de potentiel d’action dans les axones, bien que la façon dont cela puisse être accompli n’était pas claire. Nous rapportons maintenant que ces pré-NMDAR contiennent la sous-unité GluN3a leur conférant une faible sensibilité à Mg2 . Les NMDAR contenant du GluN3a au niveau des synapses PP-GC sont prépondérément présynaptiques par rapport aux postsynaptiques et persistent au-delà de la période de développement. En outre, ils sont exprimés de manière sélective au niveau des axones PP médiaux et non latéraux et agissent de manière fonctionnelle pour augmenter la probabilité de libération, en particulier de l’entrée du chemin perforant médian (MPP) dans les dendrites GC. En contrôlant la probabilité de libération, les pré-NMDAR contenant du GluN3a contrôlent également la plage dynamique de la potentialisation à long terme (LTP) des synapses MPP-GC, un effet nécessitant une signalisation de Ca 2 dans les astrocytes. Conformément aux observations fonctionnelles, les sous-unités GluN3a dans les terminaux MPP sont localisées à des sites éloignés des sites de libération présynaptiques, souvent face à des astrocytes, conformément au rôle primordial joué par les intrants astrocytaires dans leur activation. Globalement, les pré-NMDAR contenant GluN3A apparaissent comme des modulateurs atypiques des calculs dendritiques dans le circuit de mémoire MPP-GC.

Les projections excitatrices du cortex entorhinal (CE) vers le gyrus denté (DG) jouent un rôle central dans l’encodage de la mémoire ( 1 ) et sont également gravement touchées chez les humains atteints de la maladie d’Alzheimer (AD) et de l’épilepsie du lobe temporal (TLE) ( 2 ) , contribuant de manière critique aux dysfonctionnements typiques de ces pathologies ( 3 , 4 ). Toutes les projections de la CE à DG produisent des synapses glutamatergiques sur des cellules de granules dentés (GC), mais avec des propriétés fonctionnelles différentes selon les afférences provenant du trajet de perforant latéral (LPP) ou du trajet de perforant médial (MPP). Les synapses MPP présentent une probabilité de libération présynaptique plus élevée que les synapses LPP ( 5 ). Une autre différence concerne la susceptibilité à la pathologie, les synapses LPP (mais non MPP) montrant des changements de probabilité de libération dans les modèles d’épilepsie ( 6 ), un dépôt préférentiel de β-amyloïde ( 7 ), une susceptibilité plus précoce dans la MA ( 8 ) et une plasticité réduite avec l’âge ( 9 ). Les raisons de ces différences sont inconnues.

Nous et d’ autres ont précédemment montré que voie perforante (PP) projections sur dentate GC sont modulés par les astrocytes , non seulement par une expression élevée des transporteurs du glutamate de la membrane , mais aussi, par l’ intermédiaire de la libération de gliotransmetteurs sur -méthyl- présynaptique ifenprodil sensible à N d aspartate (NMDA) récepteurs (pré-NMDAR) ( 10 ). Visualisés par microscopie électronique (EM), les pré-NMDAR contenant du GluN2b sont généralement situés dans des terminaux PP éloignés de la fente synaptique, faisant directement face aux membranes astrocytaires ( 10 , 11 ). La présence de contacts directs axonocycles – PP axon est corroborée par des études de dépistage du virus de la rage ( 12 ). Le virus de la rage marque de manière rétrograde les cellules présynaptiques: dans ce cas, il est passé des projections de PP infectées à une portion d’astrocytes de DG, ce qui correspond à l’existence de sites de libération d’astrocytes à axones dédiés dotés de mécanismes de libération spécialisés ( 10 , 11 ).

La modulation dynamique de la libération de PP peut être provoquée par une stimulation astrocytaire (par exemple, par dépolarisation directe ou par activation du récepteur P2Y1 couplé à la protéine G purinergique astrocytique). Régulièrement, l’ inhibition de la signalisation astrocytaire en bloquant les récepteurs P2Y1, l’ élévation interne Ca 2 , ou exocytose élimine la modulation des astrocytes ( 10 , 13 15 ). De plus, la signalisation des astrocytes via les récepteurs du facteur de nécrose tumorale de type 1 (TNFR1), activée par des niveaux pathologiques de la cytokine, modifie de manière persistante la probabilité de libération du PP ( 14 ). De manière surprenante, tous ces effets présynaptiques des astrocytes ont été observés en présence de Mg 2 extracellulaire 2 mM, suggérant que les pré-NMDAR dans les DG ont une faible sensibilité au Mg 2 , malgré le fait qu’elles contiennent des sous-unités de GluN2b.

Les NMDAR ont été impliqués à la fois dans des processus physiologiques, tels que la formation de la mémoire, et dans des processus pathologiques, tels que ceux liés à la toxicomanie, à la MA, à la schizophrénie ou à un accident vasculaire cérébral (revu dans les réf. 16 et 17 ). Alors que la majorité de ces processus impliquent des NMDAR situés sur la membrane postsynaptique, la localisation présynaptique de ces NMDA permet un moyen unique de moduler la force synaptique en modifiant la probabilité de libération et donc l’efficacité de la transmission synaptique. Dans l’hippocampe PP, plusieurs épines post-synaptiques ( 18 , 19 ) entrent en contact avec une même varicosité présynaptique, ce qui permet à un changement présynaptique sur un seul bouton de moduler simultanément la force sur plusieurs postsynaptiques. En plus de nos observations ( 10 , 11 ), d’autres études ont rapporté des données concordant avec la présence de synapses PP-GC pré-NMDAR, notamment celles sensibles à l’idoprodil ( 20 ). De plus, NMDARs avec emplacement présynaptique ont été de plus en plus signalés et étudiés fonctionnellement dans plusieurs régions du cerveau, y compris le cervelet, le cortex et l’ hippocampe ( 21 35 ). Toutefois, des informations ont également été contestées ( 36 , 37 ) contestant les observations susmentionnées et soulevant un débat sur l’existence du système pré-NMDAR ( 38 ). Une difficulté omniprésente dans les études antérieures consistait à distinguer la véritable activation pré-NMDAR de l’activation non intentionnelle NMDAR somatodendritique dans une cellule présynaptique, qui pourrait ensuite se propager à l’axone ( 37 ). À cet égard, le PP hippocampique constitue un système idéal pour isoler les composants somatiques et axonaux, car les axones du PP peuvent s’étendre sur un millimètre entre les cellules pyramidales de la CE source et la cible GC dans l’hippocampe.

Expression de pré-NMDAR semble varier à la fois avec les circuits étudiés et avec l’ âge ( 34 , 39 43 ). La composition des sous-unités a également un effet important sur la fonction du récepteur. Structurellement, les NMDAR sont des tétramères qui peuvent être composés de deux sous-unités GluN1 et de deux sous-unités GluN2 et / ou GluN3. La composition exacte des sous-unités déterminera la cinétique du canal NMDAR, sa sensibilité au Mg 2 et sa perméabilité au Ca 2 (revue de la réf. 44 ). L’incorporation des sous-unités GluN2c, GluN2d ( 45 ) ou GluN3 réduit considérablement le bloc de Mg 2 dépendant de la tension et de la perméabilité au Ca 2 (examiné dans les réf. 16 et 46 ), permettant dans certains cas une ouverture des récepteurs même au potentiel de membrane au repos ( 47 , 48 ). Cette propriété est partagée par les NMDAR qui utilisent la signalisation métabotropique non conventionnelle via des changements de conformation sans flux ionique à travers le canal ( 49 , 50 ).

Certaines des sous-unités de récepteurs sont régulées par le développement. Par exemple, GluN3a atteint le pic d’expression du cerveau entier à -P8 et diminue progressivement avec la maturation ( 34 , 51 , 52 ). Cependant, chez certains afférents, il a été rapporté que l’expression de GluN3 persiste jusqu’à l’âge adulte (revue dans la réf. 46 ).

Étant donné que les synapses pré-NMDAR des PP-GC ont une faible sensibilité au Mg 2 , nous avons vérifié si la signalisation métabotropique ou l’incorporation de sous-unités, comme GluN3a, expliquait leurs propriétés spécifiques.

Résultats

L’application NMDA locale transitoire augmente la probabilité de libération au niveau des synapses PP-GC.

Les pré-NMDAR contenant du GluN2b sur les terminaisons axonales de PP répondent à la libération ciblée des gliotransmetteurs par les astrocytes en augmentant la probabilité de libération des synapses en PP-GC ( 10 ). Afin de mieux examiner le rôle et les propriétés de ces pré-NMDAR, nous les avons maintenant stimulés par de brèves applications locales de NMDA exogène (5 µM) tout en surveillant les récepteurs de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPAR). ) miniatures des courants postsynaptiques excitateurs (mEPSC) dans les GC patchées. Nous avons utilisé des conditions expérimentales aptes à minimiser l’activation des NMDAR dans les GC ( 10 ), notamment 2 mM de Mg 2 et de la tétrodotoxine (TTX) dans le milieu de baignade, le bloqueur NMDAR à haute affinité (MK-801; 1 mM) dans la pipette et hyperpolarisation du GC patché à -80 mV ( Fig. 1 A ). De manière fiable, nos bouffées de NMDA ont augmenté la fréquence de mEPSC ( Fig. 1 B et C ) sans changer l’amplitude et la cinétique des événements ( Fig. 1 D ), ce qui correspond à un effet présynaptique. Pour exclure les artefacts de l’application de la bouffée (par exemple, la stimulation mécanique des astrocytes à proximité), nous avons effectué des bouffées identiques dans le tissu sans solution de NMDA [CSF artificiel (aCSF)] et n’avons observé aucune potentialisation. De même, le NMDA appliqué à 0,5 µM était inefficace, alors qu’à 2 µM, il augmentait la fréquence de mEPSC ( Fig. 1 E ), suggérant un seuil micromolaire bas pour son action sur les NMDAR antérieurs.

Fig. 1.

L’application de NMDA par soufflage augmente la probabilité de libération au niveau des synapses PP-GC de souris juvéniles. ( A ) Schéma de l’approche expérimentale. Les mEPSC ont été enregistrées sur une GC patchée avant et après l’application focale de bouffées de NMDA ( 14 ) dans du liquide céphalorachidien artificiel (aCSF) contenant 2 mM de Mg2 , TTX et picrotoxine (PTX). L’activation des NMDAR GC a été minimisée en hyperpolarisant la cellule et en la dialysant avec du MK-801 intracellulaire ( 10 ). ( B ) Exemple de traces de courant synaptique montrant une fréquence accrue de mEPSC après une bouffée de 5 µM de NMDA. Les événements détectés sont indiqués par des graduations au-dessus des traces. ( C ) Données du groupe montrant un intervalle réduit entre les événements (IEI; test KS, n = 453 vs 473 événements) et une fréquence accrue de mEPSC sur une bouffée NMDA. Signification: * test t apparié P # P D ) L’amplitude et la cinétique de mEPSC n’étaient pas affectées par le NMDA. ( E ) Une augmentation de la fréquence de mEPSC induite par bouffée a été atteinte à des concentrations de NMDA ≥ 2 µM (test de Kruskal-Wallis, p = 0,025; comparaisons multiples à une valeur de confiance de 95%, n = 5 à 8%, * p

Les pré-NMDAR ne fonctionnent pas comme autorécepteurs pour le contrôle tonique de la libération de glutamate basal.

Nous avons ensuite cherché à déterminer si les synapses PP-GC pré-NMDRA régulaient de façon tonale la libération spontanée de glutamate, comme indiqué lors de diverses connexions corticales et hippocampiques ( 22 , 34 , 45 , 53 ). À cette fin, nous avons appliqué l’antagoniste d -2-amino-5-phosphonovalérate (D-APV) à large spectre de NMDAR (50 µM) et recherché des modifications du mEPSC ( Fig. 2 A ). En fait, aucun changement n’a été observé dans la fréquence mEPSC ( Fig. 2 B ), l’amplitude ou la cinétique ( Fig. 2 C ). Par conséquent, les pré-NMDAR des synapses PP-GC ne fonctionnent pas comme des autorécepteurs impliqués dans la modulation de la probabilité de libération basale.

Fig. 2

Les pré-NMDAR au niveau des synapses PP-GC manquent d’activation dans des conditions basales mais sont recrutés par stimulation électrique d’afférents MPP (mais non de LPP). ( A ) Exemples de traces dans une CPG ne montrant aucun changement dans la fréquence de mEPSC après l’application dans le bain de l’antagoniste NMDAR à large spectre D-APV et son lavage. ( B ) Données du groupe montrant que la fréquence et l’intervalle entre les événements (IEI) mEPSC n’ont pas été affectés lors de l’application de D-APV et de son lavage subséquent (tests KS et appariés t ). ( C ) De même, l’amplitude et la cinétique de mEPSC n’étaient pas affectées par la D-APV. ( D , supérieur ) Réponses eEPSC appariées représentées dans une CPG en réponse à une stimulation MPP (verte) ou LPP (rouge) en condition de contrôle et à l’application de 3 µM d’ifenprodil (bleu). ( D , Inférieur ) Évolution temporelle représentative de l’effet de l’improfil sur la PPR lorsque les synapses sont déprimées (PPR 1) (les lignes noires représentent une moyenne mobile à cinq points). ( E ) L’application d’Indprodil a entraîné une diminution significative de l’amplitude de l’impulsion 1 et une augmentation de la PPR au MPP, mais pas des synapses LPP (test t apparié). * P P

Les changements de stimulation pré-NMDAR dépendant de l’activité dépendent de la probabilité de sortie au MPP mais pas aux synapses LPP.

Pour déterminer si les synapses pré-NMDAR au niveau des synapses PP-GC sont activées par la libération évoquée de glutamate, nous avons effectué des stimulations de pouls par paires de fibres de PP et enregistré des EPSC évoqués (eEPSC) dans des GC. Nous avons stimulé séparément les afférents MPP et LPP et comparé l’effet des pré-NMDAR aux deux entrées distinctes sur les GC. Comme les pré-NMDAR aux terminaux PP contiennent GluN2b ( 10 ) et que les NMDAR contenant GluN2b au niveau des synapses PP-GC sont essentiellement présynaptiques ( 10 , 13 , 15 , 20 ), nous avons utilisé l’antagoniste sélectif pour GluN2b, ifenprodil (3 µM). ). L’application du médicament a entraîné une diminution combinée de l’amplitude de l’eEPSC et une augmentation du rapport d’impulsions appariées évoquées (PPR), généralement interprétables comme un effet présynaptique pur ( Fig. 2 D et E ). Cependant et de manière surprenante, cet effet était limité aux synapses du MPP, alors que l’improdil ne produisait aucun effet au niveau des synapses du LPP ( Fig. 2 D et E ). Pour exclure que cela dépendait d’un plus grand pool facilement libérable (RRP) ou d’une action de pré-NMDARs sur les synapses LPP sur le taux de réapprovisionnement du RRP plutôt que sur la probabilité de libération, nous avons appliqué un long train d’impulsions (30 Hz) suffisant pour épuiser la RRP ( 54 ) ( Annexe SI , Fig. S1 ). Cependant, si le produit était toujours dépourvu de tout effet, la réduction du Ca 2 externe (1 mM), qui réduit la taille du PRP, a entraîné les modifications fonctionnelles attendues ( 54 ). Par conséquent, la modulation de la probabilité de libération par les pré-NMDAR contenant du GluN2b est une caractéristique spécifique au circuit des synapses MPP-GC.

L’élimination de la sous-unité GluN3a supprime la modulation pré-NMDAR des synapses MPP mais n’a aucun effet sur les synapses LPP.

L’effet de NMDA sur les mEPSC au niveau des synapses MPP-GC est étonnant compte tenu du fait que GluN2b, sensible au ifenprodil, confère à NMDAR une sensibilité élevée de Mg 2 nécessitant un déblocage du canal dépendant de la dépolarisation, alors que NMDA augmentait la fréquence de mEPSC ( Fig. 1 ) Mg 2 extracellulaire. Ce résultat pourrait être expliqué si les pré-NMDAR agissaient de manière métabotrope ( 49 , 50 ) ou contenaient des sous-unités supplémentaires, telles que GluN2c, GluN2d ( 45 ) ou GluN3a, qui réduisent la sensibilité au Mg2 ( 16 ). La première hypothèse a été écartée, car l’acide 7-chlorokinurénique (100 µM), un médicament qui supprime le flux d’ions NMDAR mais n’affecte pas la signalisation métabotrope du récepteur ( 49 ), reproduit entièrement les effets de l’ifenprodil sur l’amplitude de eEPSC et sur la PPR ( Annexe SI , Fig. S2 ). Pour commencer à traiter la deuxième hypothèse, nous avons exploité la disponibilité de souris knock-out GluN3a en laboratoire (GluN3a – / – ) ( 51 ). Contrairement à ce qui a été observé chez des souris de type sauvage ( Fig. 1 ), la bouffée de NMDA dans les knock-outs n’a pas changé la fréquence de la MECsC ( Fig. 3 A et B ), l’amplitude ou la cinétique ( Fig. 3 C ), révélant un rôle nécessaire pour la sous-unité GluN3a dans l’action présynaptique du médicament. L’élimination de GluN3a en soi n’a pas d’incidence sur la fonction initiale des synapses non stimulées PP-GC (type GluN3a – / – par rapport au type sauvage: fréquence mEPSC, 1,91 ± 0,36 vs 1,41 ± 0,13 Hz, tests t : P > 0,10; amplitude, 7,42 ± 0,30. contre 6,96 ± 0,41, P > 0,38; temps de montée, 2,23 ± 0,13 contre 2,08 ± 0,06, P > 0,19; temps de décroissance, 5,52 ± 0,38 contre 5,03 ± 0,24, P > 0,25; n = 10 contre 22 cellules, respectivement).

Fig. 3

La sous-unité GluN3a est requise pour la modulation de MPP pré-NMDAR, mais pas pour les synapses LPP. ( A ) Exemples de traces et ( B ) données de groupe montrant que le NMDA appliqué par bouffée (5 µM) ne déclenche aucune augmentation de la fréquence mEPSC chez la souris GluN3a – / – contrairement à l’effet chez les souris de type sauvage (test t ). * ** P n = 10 contre 8). ( C ) L’application de NMDA à des souris GluN3a – / – ne modifie pas les paramètres de courant postsynaptiques (amplitude, élévation et temps de décroissance). ( D ) Les données de groupe montrant que les PPR des courants synaptiques évoqués par la stimulation du MPP (intervalle interstimulus = 50 ms) dans les GC étaient plus grandes chez les souris GluN3a – / – comparées aux coronelles de type sauvage (Kruskal – Wallis; n = 12 contre 11, * P n = 10 contre 7). ( E ) Chez des souris GluN3a – / – , l’application de ifenprodil n’a pas modifié l’amplitude de l’eEPSC et la PPR au niveau des synapses MPP et LPP (test t apparié: n = 5), contrairement à celle des souris de type sauvage ( Fig. 2 E). , Député). KO, KO; WT, type sauvage.

Nous avons ensuite testé les réponses synaptiques évoquées au niveau des synapses MPP-GC et LPP-GC chez des souris GluN3a – / – . La courbe entrée-sortie à l’une ou l’autre connexion ne différait pas significativement de la courbe dans les contrôles littermate ( Annexe SI , Fig. S3 ), ce qui suggère que l’ablation de GluN3a en soi ne modifie pas la force synaptique basale. Cependant, il a induit une augmentation faible mais significative de la PPR ( Fig. 3 D , Gauche ) sélectivement au niveau des synapses MPP-GC, signalant un contrôle modifié de la probabilité de libération en l’absence de cette sous-unité. De plus, l’application de ifenprodil chez des souris GluN3a – / – n’a pas modifié la PPR ( Fig. 3 E , Gauche ), contrairement à son effet chez des souris de type sauvage ( Fig. 2 E ), ce qui suggère que l’ablation de GluN3a et l’ifenprodil convergent pour même mécanisme pré-NMDAR dépendant de la probabilité de libération au niveau des synapses MPP-GC. L’absence de GluN3a n’a eu aucun effet sur la PPR sur les synapses LPP-GC ( Fig. 3 D , droite ), même avec l’application combinée d’ifenprodil ( Fig. 3 E , droite ), confirmant l’absence de modulation pré-NMDAR sur ces synapses.

GluN3a à PP-GC Synapses est principalement présynaptique, est concentré aux terminaux MPP et, comme la modulation dépendante du pré-NMDAR, persiste après le développement.

Nos résultats électrophysiologiques suggèrent fortement que les pré-NMDAR contenant du GluN3a sont exprimés de manière différentielle entre MPP et LPP. Pour sonder cela, nous avons utilisé preembedding EM immunomarquage en tranches DG des juvéniles et des jeunes souris adultes ( Fig. 4 A ). Pour chaque groupe d’âge, nous avons choisi un nombre représentatif de synapses positives et quantifié la distribution relative (avant / après) de puncta aurifère GluN3a à chaque synapse. En accord avec les données fonctionnelles, les puncta se sont révélés concentrés aux terminaux MPP et presque indétectables aux terminaux LPP ( Fig. 4 A , a et b vs. Fig. 4 A , c et d et B ). Quelques particules de GluN3a ont été observées de manière postsynaptique, mais la grande majorité d’entre elles se trouvaient dans les terminaisons MPP situées à des emplacements extrasynaptiques éloignés de la fente, faisant souvent face à des membranes astrocytaires ( Fig. 4 A , a Inset et b ). La coloration de GluN3a dans les terminaux MPP diminuait avec l’âge mais était toujours clairement détectée au-delà du développement ( Fig. 4 A , e et f ): les particules comptées à P45 représentaient environ 50% de celles à P21 ( Fig. 4 B ). En conséquence, environ 50% des GC enregistrées chez de jeunes souris adultes ont présenté une réponse de mEPSC au NMDA ( Fig. 4 C , gauche ) et une réponse de PPR 60% à l’ifenprodil ( Fig. 4 C , à droite ).

Fig. 4

Les sous-unités de GluN3a sont exprimées de manière pré-synaptique au niveau du MPP, mais pas des boutons axonaux de la LPP chez les souris juvéniles et les souris adultes jeunes. ( A ) Localisation subcellulaire de GluN3a dans le DG. Les micrographies électroniques montrent les immunoparticules de GluN3a détectées à l’aide de la technique d’immunogold pré-inclusion. À P21 ( A , a – d ), les immunoparticules de GluN3a dans les MPP ( A , a et b ) étaient localisées de manière prépondérante à la membrane plasmique extrasynaptique (têtes de flèches) des terminaisons axonales (at), établissant des synapses asymétriques avec des épines sur les dendrites. (Den), faisant souvent face à des profils astrocytaires (ast; A , un insert ); avec une fréquence beaucoup plus basse, ils étaient également localisés le long de la membrane plasmique extrasynaptique (flèches) des épines dendritiques. En revanche, les immunoparticules LPP ( A , c et d ) ont été détectées à basse fréquence et uniquement le long de la membrane plasmique extrasynaptique (flèches) des épines dendritiques GC. À P45 ( EH ), les immunoparticules de GluN3a dans les MPP ( A , e et f ) étaient toujours observées de manière prépondérante le long de la membrane plasmique extrasynaptique (têtes de flèches) des terminaisons axonales par rapport à la membrane plasmique extrasynaptique (flèches) des épines dendritiques mais à une fréquence plus basse qu’à P21. Immunoparti de GluN3acles dans LPP ( A em>, g em> et h em>) ont été détectés à basse fréquence, inférieure à P21 et uniquement le long de la membrane plasmique extrasynaptique ( flèches) des épines dendritiques GC. (Barres d’échelle: 500 nm.) ( B em>) Quantification de la distribution relative de puncta d’or dans les terminaisons axonales positives pour GluN3a de MPP et LPP chez des souris P21 et P45 [pour chaque condition: n em> = 45 synapses GluN3a-positives de trois souris; ANOVA unidirectionnelle sur les quatre groupes: P em> F em> valeur = 365,67, Toukey post-hoc: toutes les comparaisons par paires sont significativement différentes à P em> Gauche em>; fraction de cellules répondant à une fréquence accrue de mEPSC chez les jeunes adultes par rapport aux jeunes adultes, n = 16 vs 15, P em> 2 sup>: statistique 8.3 2 sup> 8.3299, * P em> = 0.0039) ( figure 1 ) et application ifenprodil ( Droite em>; fraction de cellules réponse avec eEPSC modification de la PPR aux synapses MPP-GC chez les jeunes adultes par rapport aux jeunes adultes, n em> = 12 vs. 7, P em> = 0,4192, 2 sup > test: χ 2 sup> statistique 0.6553) ( figure 2 ). p> div> div>

La potentialisation à long terme au niveau des synapses MPP-GC est également améliorée dans les souris GluN3a – / – sup> et chez des souris témoins ayant bloqué la signalisation 2 sup> en astrocyte. h3>

Depuis la potentialisation à long terme (LTP) au niveau des synapses MPP-GC augmentation synaptique de la libération de glutamate ( 5 ), nous avons ensuite étudié l’impact de l’ablation de GluN3a sur la plasticité synaptique dans ce circuit. La LTP induite par une stimulation haute fréquence (HFS) a été comparée chez les contrôles GluN3a – / – sup> et le littermate. Pour ces expériences, nous avons utilisé des enregistrements de potentiel de champ local ( figure 5 A em> ). Sur HFS, les souris GluN3a – / – sup> affichaient un LTP nettement plus grand dans les champs enregistrés que les contrôles ( Fig. 5 B em> ), révélant une plage dynamique accrue pour la potentialisation de ces synapses en l’absence de GluN3a. Nous avons ensuite demandé si les astrocytes étaient impliqués dans cet effet sur la base de preuves antérieures selon lesquelles les astrocytes sont recrutés par les axones de PP et y répondent en commençant par une signalisation intracellulaire de Ca 2 sup> entraînant une modification de la probabilité de libération de PP-GC. synapses ( 15 ). Profitant des protocoles déjà établis ( 10 , 15 , 55 ), nous avons utilisé des souris de type sauvage et des souris réponses de potentiel de champ enregistrées dans des champs contenant une cellule entière d’astrocyte patchée avec une solution interne contenant le chélateur de Ca 2 sup>, 1,2-Bis (2-aminophénoxy) éthane N, N, N ‘, N ′ Em> – acide tétraacétique (BAPTA) (40 mM) ( figure 5 A em> a >). La HFS-LTP mesurée dans ces champs était significativement plus grande que la LTP mesurée, dans des expériences séparées, dans des champs analogues dans lesquels les astrocytes n’étaient pas patchés, les astrocytes étaient patchés sans BAPTA, ou une pipette contenant du BAPTA était positionnée à proximité de l’électrode de champ ( Fig. 5 C em> ). Par conséquent, le blocage des élévations de Ca 2 sup> dans les astrocytes reproduit l’effet observé sur la LTP chez les souris GluN3a – / – sup>, ce qui suggère fortement que les deux manœuvres interfèrent avec le même mécanisme et par conséquent , le recrutement de pré-NMDAR dans la LTP implique une signalisation intermédiaire des astrocytes. p>

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Fig. 5. Span>

La plage dynamique de HFS-LTP au niveau des synapses MPP-GC augmente chez les souris dépourvues de GluN3a ou lors de la perturbation sélective de Ca 2 sup> dans les astrocytes la signalisation chez les souris de type sauvage. A em>) Schéma de l’expérience de LTP (mesures du potentiel de champ local) chez des souris GluN3a – / – sup> ( Upper em>) ou de type sauvage animaux avec astrocytes cellules entières serrées avec une solution interne contenant BAPTA pour bloquer les transitoires Ca 2 sup> ( Inférieur em>). B em>) HFS tétanique (100 Hz pendant 1 s, répétée trois fois) produit une LTP plus importante chez les souris GluN3a – / – sup> par rapport aux souris de type sauvage (type sauvage: huit tranches, GluN3a – / – sup>: sept tranches). Statistiques: tests de KS sur les valeurs (non normalisées) entre 20 et 40 min après l’induction: potentiel postsynaptique excitateur de champ (fEPSP): amplitude: statistiques KS 0.266, PPR: statistique KS 0.2022. ** P em> C em>) Le calcium astrocytaire bloquant (BAPTA 40 mM) augmente la LTP locale mesurée à proximité immédiate de l’astrocyte patché. * P em> div> div> div> div>

Discussion h2>

Ici, nous avons étudié les propriétés des pré-NMDAR au niveau des synapses corticohippocampiques PP-GC. Comprendre de telles propriétés est important au vu des spécificités fonctionnelles de ce circuit (par exemple, en codage en mémoire) et de son dysfonctionnement dans des conditions telles que la sclérose en plaques, la DA et la TLE. Des travaux antérieurs ont montré que les pré-NMDAR dans ce circuit sont particuliers, car ils peuvent être activés paradoxalement – même s’ils contiennent la sous-unité GluN2b – même dans du Mg extracellulaire 2 mM 2 sup> et TTX ( 10 , 14 ). Pour expliquer cette propriété, nous avons exploré les modes non conventionnels de la fonction NMDAR, tels que la signalisation métabotropique ( 49 ), puis trouvé l’incorporation d’une sous-unité GluN3a dans le récepteur peut en rendre compte. L’évolution dans le temps de l’expression et de la fonction de GluN3a aux terminaux PP est également atypique: bien qu’elle culmine généralement au début du développement ( 46 ), ici la sous-unité persiste jusqu’à l’âge adulte et éventuellement plus longtemps ( 14 a >). L’immunoréactivité de GluN3a est toujours bien détectable dans les terminaux MPP à P45 et les effets fonctionnels du pré-NMDAR insensible au Mg 2 sup> sont présents dans une bonne partie des souris P30 – P40, mais sont déjà éliminés chez les jeunes souris. manque de GluN3a. p>

Une autre propriété intrigante des pré-NMDAR contenant du GluN3a au niveau des synapses PP-GC est leur indisponibilité pour la fonction d’autorécepteur tonique en réponse à la libération spontanée de glutamate. Ainsi, un antagoniste de NMDAR à large spectre, D-APV, n’a pas réussi à affecter la fréquence des MECsP ( Fig. 2 A em> – C em> ), en contraste frappant avec son efficacité dans plusieurs autres circuits cérébraux exprimant des pré-NMDARs contenant GluN3a ( 22 , 34 , 45 , 53 ). Cependant, les effets des NMDA exogènes sur les mEPSC et des antagonistes du NMDAR sur les eEPSC et la PPR indiquent que les pré-NMDAR s’activent dans des conditions de libération accrue de glutamate. Cela pourrait dépendre des débordements des synapses voisines ou de la libération d’astrocytes ou d’autres cellules. Des débordements synaptiques ou des mécanismes nécessitant la diffusion du glutamate à une certaine distance semblent peu probables compte tenu de la forte densité de transporteurs de glutamate dans les processus astrocytaires périsynaptiques ( 11 a >) et le contrôle étroit qu’ils exercent sur le glutamate extracellulaire au niveau de ces synapses ( 13 ), empêchant probablement également Fonction autorécepteur NMDAR. La libération de glutamate par les astrocytes semble donc être le mécanisme le plus réaliste, bien que non conventionnel, de l’activation pré-NMDAR au niveau des synapses PP-GC. Les preuves convergentes à l’appui incluent que ( i em>) les astrocytes forment apparemment des connexions de type synaptique avec les axones PP et fonctionnent comme leur entrée «présynaptique» ( 12 ); Les ii em>) pré-NMDAR dans les terminaux MPP sont principalement positionnés en regard des astrocytes ( 10 a >) ( figure 4 ); iii em>) La stimulation astrocytaire déclenche la libération du glutamate en fonction du Ca 2 sup> ( 10 , 13 ) et, de plus, augmente la fréquence mEPSC, comme l’application NMDA, avec les deux effets être sensible à la norme ifenprodil ( 10 , 13 ) ( figure 1 ); et ( iv em>) la mise à feu axonale en PP recrute la signalisation de l’astrocyte Ca 2 sup> et la suppression de cette signalisation diminue la probabilité de libération de PP ( 15 , 56 ). Enfin, un soutien encore plus direct provient de ces expériences LTP montrant un effet identique sur la plasticité en ablant GluN3a ou en perturbant la signalisation Ca 2 sup> dans les astrocytes ( Fig. 5 ). p>

Les NMDAR contenant GluN3a au niveau des synapses PP-GC sont prépondérantes par rapport aux fonctions post-synaptiques. Selon les connaissances actuelles, la présence de pré-NMDAR varie considérablement entre les différentes régions et circuits du cerveau et peut être étroitement réglementée par le développement ( 57 a>, 58 ). En cohérence avec cette diversité, nous rapportons une spécificité surprenante dans la localisation pré-NMDAR dans les récepteurs de la DG: Les récepteurs contenant GluN3a sont exprimés sélectivement au niveau des axones MPP – et non LPP. Une telle ségrégation est clairement évidente dans plusieurs cohortes d’âge ( figure 4 ), paradigmes électrophysiologiques ( Figures 2 et 3 ) et techniques d’enquête : EM et électrophysiologie. On ne comprend pas pour le moment pourquoi il existe une telle sélectivité critique des fibres MPP par rapport aux fibres LPP en ce qui concerne leur capacité à moduler leurs entrées au niveau des synapses à proximité sur le même GC. Le cas, cependant, n’est pas unique. Une modulation différentielle similaire de deux entrées convergeant vers la même cible a été rapportée (par exemple, dans le cervelet, où les cellules de Purkinje reçoivent des entrées excitatrices fonctionnellement distinctes de fibres grimpantes dépressives pour la PPR et de fibres parallèles fortement facilitant la PPR et où seule la première est modulée via les récepteurs présynaptiques α 2 sub> -noradrénergiques) ( 59 ). Compte tenu de la complexité du filtrage et de l’intégration dendritiques, on peut supposer que la modulation différentielle peut refléter un besoin de traitement des entrées différemment selon une ou plusieurs de ces raisons: distance électrotonique différente des synapses ( 60 ), différents débuts de synchronisation de pointes, des modèles d’activité intrinsèquement différents des cellules d’origine ou une nature différente des informations acheminées par les entrées. En ce qui concerne ce dernier aspect, les études sur les lésions ont amené à proposer que LPP et MPP transmettent effectivement des informations différentes dans l’hippocampe ( 61 a >, 62 ), le LPP plus sensoriel, le MPP associé à l’état limbique ( 61 ). De plus, les informations sur la localisation spatiale pourraient être acheminées préférentiellement par les afférents du LPP, tandis que les signaux liés à l’attention, à la motivation et à l’entraînement pourraient être acheminés préférentiellement aux MPP ( 63 ). Ainsi, la modulation différentielle d’une voie mais pas de l’autre voie peut remodeler le calcul dendritique local, permettant ainsi le stockage et le transfert d’informations à long terme propres à la voie et, finalement, des résultats cognitifs différents. P>

In Conformément aux considérations ci-dessus, la modulation dépendant du pré-NMDAR contribue probablement aux différences importantes de physiologie des synapses du MPP par rapport au LPP [par exemple, en termes de probabilité de libération et de formes LTP ( 64 , 65 )] et dans les différentes sensibilités à pathologie ( 3 , 4 ). La LTP modifiée au niveau des synapses MPP-GC chez les souris GluN3a – / – sup> révèle la contribution des pré-NMDARs contenant GluN3a aux propriétés de la plasticité synaptique de ces synapses. En augmentant la probabilité de libération, les pré-NMDAR renforcent la connectivité MPP-GC dans des conditions de déclenchement clairsemé, mais pendant les périodes de haute fréquence, l’effet pré-NMDAR peut en fait réduire leur plage dynamique de potentialisation. Ainsi, la LTP améliorée observée chez les souris GluN3a – / – sup> (ou lors de la suppression des élévations de l’astrocyte Ca 2 sup>) reflète probablement l’absence d’état basal de «prépotentiation» imposé par -NMDAR chez les souris normales. Il est important de noter que nous avons récemment décrit que l’inflammation provoque une activation excessive pré-NMDAR via la signalisation dépendante de TNFR1 dans les astrocytes dans un modèle murin de sclérose en plaques. L’altération de l’entrée modulatrice entraîne à son tour le réglage du mode de probabilité de libération élevée des synapses PP-GC, effet que nous avons trouvé associé à une mémoire contextuelle altérée ( 14 ). p>

Des effets importants et divers de l’expression de GluN3a sur la plasticité synaptique à long terme dépendante de NMDAR ont déjà été rapportés dans divers circuits, notamment dans l’hippocampe ( 66 span> 68 ) et cortex visuel ( 34 , 43 ), mais les astrocytes n’avaient jamais été décrits auparavant comme activateurs de tels récepteurs. Par exemple, une augmentation de la LTP sur le knockout de GluN3a (et une diminution de la surexpression de GluN3a) avait déjà été rapportée à la fois dans l’hippocampe CA1 et dans DG ( 66 span> 68 ), mais les effets de GluN3a ont été jugés postsynaptiques et le rôle de cette sous-unité a été interprété principalement comme un » frein « empêchant la maturation de la synapse et expression complète de la plasticité dépendante de NMDAR ( 58 , 67 ). Dans le cortex visuel, GluN3a s’est avéré nécessaire pour l’induction de la dépression à long terme (t-LTD) dépendante de la période de pics pré-NMDAR au niveau des synapses de L4 à L2 / 3, et son expression s’est avérée être régulée. en fonction de l’âge et modulé par l’expérience sensorielle de la vie adulte ( 34 , 43 ). Bien qu’aucun rôle pour les astrocytes n’ait été décrit dans l’activation de ces pré-NMDARs contenant du GluN3a, une étude antérieure sur la t-LTD au niveau des synapses L4 à L2 / 3 du cortex tonneau impliquait en fait que la libération de glutamate astrocytaire était une condition essentielle du traitement. NMDAR ( 35 ), mais n’a pas exploré l’implication de GluN3a. P>

Au niveau des synapses MPP-GC, la transition de la période de développement à l’âge adulte est accompagnée d’une expression partiellement réduite des sous-unités de GluN3a et de pré-NMDARs contenant des GluN3a fonctionnels, semblables aux observations dans le cortex visuel. Cela pourrait permettre d’affiner le raffinement du circuit avec un groupe plus sélectionné de synapses MPP-GC subissant une modulation pré-NMDAR dépendante de GluN3a, mais aussi le passage à un type de modulation différent au niveau des synapses qui perdent l’expression de GluN3a, mais pas celle d’autres sous-unités. comme GluN2b. Ainsi, le pré-NMDAR dépourvu de GluN3a deviendra sensible à Mg 2 sup> et nécessitera des conditions d’activation plus strictes, comme une dépolarisation coïncidente des terminaux pour libérer le bloc Mg 2 sup>. Ce commutateur peut donc limiter les circonstances dans lesquelles la probabilité de libération est augmentée, ce qui a une incidence sur le contrôle de la PLT et, en général, sur les calculs de ce circuit synaptique. P>

Les travaux futurs devront traiter les points ci-dessus et certains aspects critiques supplémentaires soulevés par ces résultats. Pourquoi une modulation sélective de l’entrée MPP est-elle nécessaire? Que transmet cette entrée aux calculs dendritiques du GC qui diffère de l’entrée LPP et qui peut nécessiter une plasticité différentielle à appliquer? Quelles sont les implications pour les pathologies affectant sélectivement LPP vs MPP, telles que AD ( 3 , 4 )? Pourquoi et comment appelle-t-on les astrocytes à participer à ce contrôle mais seulement à l’une des deux voies? Quel est le système effecteur moléculaire contrôlant la probabilité de libération synaptique en aval de l’activation pré-NMDAR? P> div>

Matériel et méthodes h2>

Tranches de cerveau. h3>

Les souris ont été profondément anesthésiées à l’isoflurane et décapitées conformément aux autorisations relatives aux procédures d’expérimentation animale de l’Office vétérinaire. du canton de Vaud (Suisse). Des tranches horizontales d’hippocampe (350 μm d’épaisseur) destinées aux expériences électrophysiologiques ont été préparées à partir de souris P17 à P22, à l’exception des expériences LTP (P17 – P30) et liées à l’âge (P20 – P40), à l’aide d’un microtome à lame vibrante (HM 650 V Microm ou Leica VT1000). La solution de tranchage à froid contenait (en millimolaire) 62,5 NaCl, 2,5 KCl, 7 MgCl 2 sub>, 0,5 CaCl 2 sub>, 25 NaHCO 3 sub>, 1,5 NaH 2 sub> PO 4 sub>, 10 glucose et 105 saccharose à pH 7,4 (barbotage avec un mélange de 95% O 2 sub> et 5% CO 2 sub>). Après la coupe, les tranches ont été conservées dans une cuve de trempe dans une chambre de submersion à 34 ° C pendant 5 à 6 heures. aCSF utilisé pour les enregistrements électrophysiologiques contenait (en millimolaire) 125 NaCl, 2 KCl, 2 MgCl 2 sub>, 2 CaCl 2 sub> (sauf pour un ensemble d’expériences en faible teneur en Ca 2 sup>, dans lequel 1 seul CaCl 2 sub> était présent), 25 NaHCO 3 sub>, 1,2 NaH 2 sub> PO 4 sub>, et 10 glucose à pH nominal 7,4 (barbotage avec un mélange de 95% de O 2 sub> et de 5% de CO 2 sub>). p> div >

Electrophysiologie. h3>

Tous les enregistrements ont été réalisés à 34 ° C. Les courants et potentiels d’action médiés par le récepteur de l’acide y-aminobutyrique de type A ont été systématiquement bloqués, sauf indication contraire, en ajoutant de la picrotoxine (100 μM) et du TTX (1 μM) à la solution d’enregistrement. Dans des ensembles d’expériences spécifiques, les courants médiés par NMDAR ont été bloqués par addition de D-APV (50 µM), d’ifenprodil (3 µM) ou d’acide 7-chlorokynurénique (100 µM) comme indiqué. Les GC GC de l’hippocampe ont été identifiés visuellement en mode de contraste par interférence différentielle infrarouge à l’aide d’une caméra infrarouge et d’un microscope droit à étage fixe (Olympus BX51WI). Dans de nombreuses expériences, des enregistrements de cellules entières à partir de GC ont été réalisés avec des pipettes patch de ∼3 à 5-MΩ contenant de l’acide (en millimolaire) 117,5 Cs, 17,5 CsCl, 10 4- (2-hydroxyéthyl) -1-pipérazinéthanesulfonique (Hepes). , 0,2 éthylène glycol-bis (β-aminoéthyl éther) – N, N, N ‘, N’ em> -tétraacétique, 8 NaCl, 2 MgATP, 0,3 NaGTP, 5 QX314 et 1 MK-801 (pH 7,2, osmolarité: 295 mOsm). Des mEPSC médiées par AMPAR ont été enregistrées à partir de GC maintenues à un potentiel de rétention de -80 mV en présence de MK-801 intracellulaire (1 mM) et de Mg extracellulaire 2 mM 2 sup> afin de minimiser l’activation de NMDAR post-synaptiques ( 10 ). La combinaison de l’hyperpolarisation GC et du MK-801 intracellulaire s’est avérée utile à cette fin, car il a récemment été rapporté que le MK-801 intracellulaire ne bloquait pas toujours complètement le NMDAR ( 69 ). Les cellules rapiécées ont été conservées pendant au moins 15 minutes avant le gonflement de NMDA pour permettre à MK801 de diffuser vers les dendrites distales. Les traces sans intervalle ont été acquises à l’aide de l’amplificateur MultiClamp 700B et numérisées à 50 kHz à l’aide de Digidata 1440. Les courants synaptiques ont été filtrés à l’aide d’un filtre passe-bas à 1 kHz à l’aide d’un filtre Bessel à quatre pôles. Dans d’autres séries d’expériences, des courants synaptiques évoqués électriquement, soit des eEPSC ou des fEPSP, ont été mesurés. Les stimulations électriques ont été sélectivement ciblées vers les entrées MPP ou LPP en plaçant l’électrode de stimulation dans le tiers moyen ou externe de la couche moléculaire dentée, respectivement. Pour les mesures d’impulsions appariées, les deux impulsions ont été séparées de 50 ms (20 Hz) et chaque impulsion de test était délivrée une fois toutes les 20 ou 30 s. Dans certaines expériences, nous avons utilisé un protocole de stimulation à 30 Hz pour épuiser le PRP des vésicules synaptiques ( 54 ). Pour les expériences évaluant la LTP, des électrodes pour la mesure de champ ont été insérées dans le tiers central de la couche moléculaire. Le protocole d’induction de la PLT consistait en deux à trois HFS de 100 impulsions pendant 1 seconde séparées par un intervalle de 20 secondes; des expériences ont été effectuées dans 2 mM de Mg 2 sup> et sans addition d’antagonistes. Pour sonder le rôle de la signalisation Ca 2 sup> astrocytaire dans la LTP, nous avons patché un astrocyte situé à proximité de l’électrode de champ et nous l’avons dialyé avec le chélateur BAPTA (40) de Ca 2 sup>. mM) ( 10 , 13 , 15 ). P>

Pour les enregistrements sur le terrain, la force de stimulation a été choisie pour correspondre à environ 30 à 40% de la réponse maximale. Les courbes entrée-sortie ont été mesurées en incrémentant progressivement la force de stimulation de 10 µA par balayage (délivré toutes les 30 s). Les données ont été écartées si la résistance en série a changé de plus de 20% (pour les expériences sur des cellules entières) ou si l’amplitude du fEPSP a changé de plus de 15% 15 min avant la stimulation (pour les expériences d’enregistrement sur le terrain). P> div>

Souris GluN3a Knockout. h3>

Souris GluN3a – / – sup> (également appelé NR3a – / – sup>) ont été générés comme précédemment ( 51 ) et maintenus en tant qu’hétérozygotes. Ils se développaient normalement et n’étaient pas sensiblement différents des contrôles du litter par leur poids corporel ou leur comportement apparent, bien que certaines différences aient déjà été rapportées ( 51 , 70 ). Des souris des deux sexes ont été utilisées. P> div>

Application de bouffée locale NMDA. H3>

Application de bouffée locale de l’aCSF ou du NMDA à diverses concentrations (0,5 à 5 µM) a été réalisée à l’aide d’un picospritzer à commande électronique (PV830 pneumatique PicoPump) décrit précédemment ( 14 ). La pipette d’éjection a été placée dans la couche moléculaire dentée et une seule impulsion de 10 secondes (4 à 7 psi) a été appliquée. La diffusion spatiale a été vérifiée indirectement dans certaines expériences en co-injectant un colorant fluorescent sous imagerie à deux photons. Au plateau, la diffusion du colorant a créé un volume sphérique avec un rayon de µ25 µm. L’administration locale évite les effets indirects dépendants du NMDA sur les axones PP médiés par l’activation des récepteurs somatodendritiques sur les cellules pyramidales distales dans la CE. P> div>

Analyse. H3 >

Les traces de courant continu enregistrées sur des CPG ont été divisées en épisodes de 60 secondes et les événements mEPSC ont été détectés à l’aide du logiciel d’analyse Mini (v6.0, Synaptosoft) sous la surveillance continue de l’utilisateur. À partir de ces données, la fréquence moyenne des événements, leur amplitude et leur cinétique (constantes de temps de montée et de décroissance) ont été automatiquement calculées pour chaque point de temps expérimental (un seul intervalle de 60 s). Le pourcentage d’augmentation après l’application de NMDA a été calculé en divisant la fréquence de MEPSC observée après une bouffée de NMDA par la fréquence de base enregistrée 1 min avant la bouffée de NMDA. D’après des expériences initiales portant sur l’effet NMDA entre 1 et 30 minutes après l’application de la bouffée et des observations antérieures de modulation du mEPSC pré-NMDAR dépendant du facteur de nécrose tumorale-α ( 14 ), le temps de 20 minutes a été choisi comme plateau des effets du médicament. Les amplitudes et les PPR des courants évoqués ont été mesurés dans Clampfit. La PPR a été calculée en divisant l’amplitude du pic 2 par l’amplitude du pic 1. p> div>

Statistiques. H3>

La signification statistique des observations a été évaluée à l’aide des tests t em> de Student non appariés, ANOVA, 2 2 sup> et de Kolmogorov – Smirnov (KS), comme indiqué. Les distributions cumulées ont été comparées à l’aide d’un test KS non paramétrique. Des tests non paramétriques de Kruskal-Wallis avec des procédures de comparaisons multiples ont été réalisés à l’aide de Dataplot (NIST). Pour les tests t em>, la normalité a été testée à l’aide de Shapiro – Wilk (logiciel Origin 8; OriginLab). Pour la Fig. 4 B em> , des ANOVA unidirectionnelles et bidirectionnelles ont été réalisées. Les résultats de l’ANOVA unidirectionnelle sont rapportés dans Fig. 4 B em> , et le test de Levene indique que les variances de population sont significativement différentes au niveau 0,05. Les résultats de l’ANOVA à deux voies sont les suivants: une différence statistiquement significative a été constatée (à P em> div>

Immunohistochimie pour l’EM. H3>

Des réactions immunohistochimiques pour l’EM ont été effectuées en utilisant la méthode de préimprégnation pré-enrobage décrite précédemment ( 71 ). Brièvement, des sections flottantes ont été incubées dans du sérum de chèvre normal (NGS) à 10% (vol / vol) dilué dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS). Les coupes ont ensuite été incubées dans un anticorps anti-GluN3a [3–5 µg / mL dilué dans du TBS contenant 1% (vol / vol) de NGS]. La spécificité des anticorps a été précédemment confirmée par des expériences sur des souris knock-out GluN3a ( 72 ). Ceci a été suivi d’une incubation dans une immunoglobuline G anti-souris de chèvre couplée à de l’or à 1,4 nm (Nanoprobes Inc.). Les coupes ont été postfixées dans du glutaraldéhyde à 1% (vol / vol) et lavées dans de l’eau bidistillée, puis enrichies en argent des particules d’or avec un kit HQ Silver (Nanoprobes Inc.). Les coupes ont ensuite été traitées avec du tétraoxyde d’osmium (1% dans du tampon phosphate 0,1 M), colorées en bloc avec de l’acétate d’uranyle, déshydratées dans une série graduée d’éthanol et intégrées à plat sur des lames de verre en résine Durcupan (Fluka). Les régions d’intérêt ont été coupées à 70–90 nm sur un ultramicrotome (Reichert Ultracut E; Leica) et recueillies sur des grilles de cuivre à une seule fente revêtues de pioloforme. La coloration a été réalisée sur des gouttes d’acétate d’uranyle en solution aqueuse à 1%, suivies du citrate de plomb de Reynolds. Des analyses ultrastructurales ont été effectuées dans un microscope électronique Jeol-1010. P> div>

Quantification de l’immunoréactivité de GluN3a. H3>

Pour établir l’abondance relative de l’immunoréactivité de GluN3a dans le MPP ou le LPP de la couche moléculaire de DG, des tranches coronales de 60 µm d’épaisseur ont été traitées pour l’immunohistochimie d’immunogold pré-incrustée (voir ci-dessus). Des blocs d’inclusion ont été préparés à l’aide de trois échantillons de tissu par souris provenant de trois souris à P21 ou à P45 (pour un total de neuf blocs par âge). Pour minimiser les faux négatifs, des coupes ultraminces en série au microscope électronique ont été effectuées près de la surface de chaque bloc, car l’immunoréactivité a diminué avec la profondeur. Nous avons estimé la qualité de l’immuno-marquage en sélectionnant toujours les zones avec un marquage à l’or optimal à une distance approximativement égale de la surface de coupe. Les zones sélectionnées au hasard ont ensuite été photographiées à partir des sections ultra-fines sélectionnées et imprimées avec un grossissement final de 60 000 ×. Nous avons compté les immunoparticules identifiées dans chaque zone de référence et présentes le long de la membrane plasmique dans deux compartiments subcellulaires différents: les épines dendritiques et les terminaisons axonales. Les profils ont été sélectionnés pour l’échantillonnage lorsque les épines dendritiques ou les terminaisons axonales contenaient au moins une particule d’or. P> div>

Disponibilité des données. H3>

Toutes les données nécessaires pour évaluer les conclusions du document sont contenues dans les figures. Les enregistrements originaux sont stockés sur le serveur institutionnel et sont disponibles auprès de l’auteur correspondant, sur demande raisonnable. P> div> div>

Remerciements h2>

Ce travail a été financé par Grant Advanced du Conseil européen de la recherche, 340368 “Astromnesis”; Subventions du Fonds national suisse 31003A-173124/1, 51NF40-160620 [Centre de compétences en recherche (NCCR) «Transcure»] et 51NF40-158776 («Synapsy»); Subvention de base Synapsis 2018-PI01 (à A.V.); Subvention du ministère espagnol de l’éducation et des sciences BFU2015-63769-R; et subvention des communes de Castille-La Manche, PPII-2014-005-P (à R.L.). Nous remercions Claire Cooper et Nicolas Liaudet d’avoir participé à des expériences et à des analyses pilotes. Nous remercions également Nobuki Nakanishi et Stuart Lipton d’avoir fourni des souris GluN3a – / – sup> et Isabel Perez-Otano pour des discussions et des conseils utiles. P> div>

Notes de bas de page h2>

  • Contributions des auteurs: recherches conçues pour les systèmes IS et AV; recherches IS, MADC, RA, HS et RL; données analysées pour IS, MADC, RA et RL; caractérisation HS et entretenu les colonies GluN3a – / – sup> et les contrôles de litterre apparentés, les expériences de microscopie électronique conçues par RL et IS, MADC et AV ont écrit le document. p> li>

  • Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts. P> li>

  • PJS est un éditeur invité sur invitation du comité de rédaction. P> li>

  • Voir le commentaire sur page 13166 . p> li>

  • Cet article contient des informations complémentaires à l’adresse www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1816013116/-/DCSupplemental . p> li> ul> div>